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5: Metabolismo Bacteriano - Biologia

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Bio 440: Metabolismo / Fluxo de Energia Ch 5 Tortora

Introdução: Fluxo de Energia

1. Principal fonte de energia da Terra = luz do Sol!

- energia da luz solar convertida em energia química por fotoautotróficos (cianobactérias, plantas verdes)

- literalmente "autoalimentadores"

-luz = fonte de energia; CO2 = fonte de carbono

-fotossíntese:

6CO2 + 6H2O + energia da luz >>>> C6H12O6+ 6O2

clorofila a glicose oxigênio para aeróbios

2. As moléculas orgânicas fotoautotróficas produzidas são essenciais para a sobrevivência dos quimioheterotróficos, organismos que requerem moléculas orgânicas pré-formadas como fonte de carbono e energia (como nós).

- Organismos aeróbicos (ex-humanos) podem usar glicose como fonte de carbono e energia em um processo chamado respiração aeróbica (a reação "oposta" da fotossíntese)

- glicose C6H12O6+ 6O2 >>> 6CO2+ 6H2O + Muita Energia!

-outros organismos que não podem realizar a respiração aeróbica podem usar o metabolismo anaeróbico, por exemplo a fermentação, como um meio de liberar energia da glicose

glicose-> produtos de fermentação (ácidos, álcoois) + um pouco de energia

3. Fotoheterotróficos e quimioautotróficos

Fotoautotróficos

Quimioheterotróficos

têm clorofila ou outros pigmentos fotossintéticos

falta clorofila e outros pigmentos ps

1. plantas verdes

1. humano / animais

2. cianobactérias

2. fungos

3. “outras“ bactérias fotossintéticas

3. "protozoários" (desculpe!)

4. bactérias não fotossintéticas, todos os patógenos bacterianos

I. Metabolismo

(adaptado do Dr. L. Heffernan CSU Sacramento)

A. Metabolismo: todas as reações químicas na célula, tanto as reações catabólicas quanto as anabólicas.

1. Reações catabólicas: reações degradativas, grandes substâncias divididas em substâncias menores com liberação de energia

uma. Alguma energia é capturada em ATP / outras moléculas de alta energia / gradientes de prótons; célula requer energia para biossíntese (anabolismo), motilidade, transporte ativo.

b. Substâncias menores podem ser usadas como blocos de construção em reações anabólicas

2. Reações anabólicas: reações biossintéticas, substâncias menores unidas com entrada líquida de energia (ATP de reações catabólicas) para sintetizar substâncias maiores para a estrutura / produtos celulares.

3. ATP = trifosfato de adenosina liga as reações anabólicas e catabólicas

B. Captura de energia por transferência de elétrons

1. Os elétrons carregam energia e podem transferir energia de uma molécula para outra

2. elétrons podem ser transferidos como elétrons "nus" ou como parte de átomos de hidrogênio

(H = H + + elétron), portanto a transferência de átomos de hidrogênio representa a transferência de elétrons.

3. A transferência de elétrons está envolvida na síntese de ATP

C. Tipos de transferência de elétrons

1. oxidação: perda de elétrons para um aceitador de elétrons

2. redução: ganho de elétrons de um doador de elétrons

3. reações redox: uma substância perde elétrons e outra substância aceita esses elétrons

uma. substância que perde elétrons é oxidada e é chamada de doador de elétrons ou agente redutor

b. substância que ganha elétrons é reduzida e é chamada de aceptor de elétrons ou agente oxidante

c. exemplo de reação redox: oxidação completa da glicose via glicólise e respiração aeróbia. A glicose é oxidada e atua como agente redutor. O O2 é reduzido e atua como um agente oxidante. Os elétrons da glicose são eventualmente doados para o O2.

oxidação ---->

C6H12O6+ 6O2----> 6CO2+ 6H2O + Energia (calor + ATP + gradiente de prótons)

redução ------->

4. Reação redox envolvendo portadores elétron / H NAD + e FAD (coenzimas): dinucleotídeo de nicotinamida adenina e dinucleotídeo de flavina adenina

uma. NAD + pode transportar átomo de hidrogênio e elétron adicionais: NAD + + 2H -> NADH + H +

b. FAD pode carregar 2 átomos de H: FAD + 2H -> FADH2

c. NADH e FADH2 carregam elétrons de alta energia para a cadeia de transporte de elétrons na membrana celular bacteriana (ou membrana mitocondrial interna em eucariotos)

D. As reações metabólicas nas células requerem

1. As reações metabólicas ocorrem muito lentamente nas células para sustentar a vida

2. O aumento da temperatura para aumentar as taxas de reação mataria as células (proteínas de desnaturação / DNA)

3. Portanto, todas as células têm catalisadores de proteínas chamados enzimas para aumentar as taxas de reação

uma. catalisadores: substâncias que reduzem a energia de ativação das reações químicas

-energia de ativação: energia necessária para iniciar as reações químicas

- ver os diagramas de quadro / texto / Ppt

reação catabólica

energia

___________________________

progresso da reação

E. Estrutura e função da enzima

1. As enzimas são catalisadores de proteínas constituídos por sequências de aminoácidos específicas que ditam a dobragem e a forma tridimensional / forma funcional

uma. dobrar cria um sítio ativo onde a enzima se liga ao seu substrato específico

b. substrato: a substância à qual a enzima se liga e "muda"

c. "Fechadura e chave" vs "ajuste induzido" do substrato no sítio ativo da enzima

d. enzima (E) e substrato (S) ligam-se e formam complexos enzima: substrato; as ligações do substrato são reorganizadas, o produto (P) é formado. O produto é liberado do sítio ativo da enzima.

E + S -> E: S -> E + P

e. a enzima não é "gasta" e pode ser usada repetidamente

2. As enzimas são proteínas e podem ser desnaturadas; perda da forma 3-D = perda de função (calor, pH etc)

3. As enzimas são específicas do substrato. As enzimas geralmente catalisam apenas uma única reação, agem em um único substrato ou substratos intimamente relacionados (determinado pela forma, tamanho e distribuição de carga do substrato e capacidade de se ajustar ao sítio ativo)

4. Enzimas classificadas de acordo com a função. exemplos:

isomerases aldeído <-> grupo cetona

desidrogenase ou redutase: remoção e transferência de elétrons de uma substância para outra. Alguns requerem coenzimas: ex NAD + e FAD atuam como portadores de elétron / H

transferase: transfere uma cadeia lateral

quinase: uma fosfotransferase, transfere o grupo fosfato de ATP para outra molécula ATP + R -> ADP + R-P

5. Sufixo enzimático “-ase”; nomeado de acordo com o substrato e a função ex. glicose-6-fosfato desidrogenase = enzima que desidrogena, remove hidrogênio, a partir de glicose-6-fosfato

6. Inibição enzimática: inibição competitiva vs não competitiva / controle alostérico.

-Feedback ou inibição do produto final.

- inibidores de enzimas antimicrobianas: por ex.

uma. antibióticos beta-lactâmicos: inibidores competitivos irreversíveis das transpeptidases bacterianas

b. -fluoroquinolonas e girase bacteriana

c. combo-trimethorpim-sulfa (por exemplo, Bactrim) como inibidores competitivos sequenciais de enzimas de síntese de ácido fólico

-ácido fólico-> coenzima necessária para a síntese de ácido nucleico

F. Vias metabólicas: série de reações químicas em que o produto da primeira reação é substrato para a etapa subsequente catalisada por enzima

1. Cada etapa de uma via metabólica requer uma enzima específica

enzimas a b c d

caminho A ----> B -----> C ---> D ---> E (produto final)

substratos / intermediários

2. Se uma enzima na via está ausente ou defeituosa, a célula não pode formar o produto final da via

nem quaisquer intermediários "a jusante" da enzima ausente

G. Coenzimas e cofatores: substâncias exigidas por algumas enzimas para plena atividade

1. enzima sem cofator / coenzima = apoenzima; com cofator / coenzima = holoenzima

2. coenzimas: moléculas orgânicas (NAD +, FAD, citocromos), vagamente associadas à enzima. Freqüentemente formado a partir de vitaminas ex niacina-> NAD + nicotinamida adenina dinucleotídeo. NAD + é importante em muitas reações redox. NAD + (baixa energia) + 2H -> NADH (alta energia) + H +

3. cofatores: inorgânicos ex magnésio, cálcio, zinco. Freqüentemente, melhora o ajuste do substrato para a.s.

H. Processos metabólicos de quimioheterotróficos: fonte de energia = oxidação de substâncias orgânicas, fonte de carbono = moléculas orgânicas pré-formadas

1. a maioria das bactérias, todos os patógenos

2. processos metabólicos: glicólise, fermentação, respiração aeróbica / anaeróbica

3. Glicólise: oxidação da glicose a ácido pirúvico com síntese de ATP (via fosforilação em nível de substrato); sem necessidade de O2, sem geração de CO2, NAD + é aceitador de elétrons; captura ineficiente de energia de glicose em ATP. Produto final do piruvato ainda rico em energia.

4. Fermentação: processo anaeróbio, conversão de ácido pirúvico / piruvato em ácidos (mais reduzidos), álcoois, gás; “Internas”, as moléculas orgânicas atuam como aceptores de elétrons finais / terminais.

-Baixa eficiência de captura de energia em ATP da glicose.

5. Respiração aeróbica: glicólise e oxidação completa do ácido pirúvico a CO2 e H2O na presença de O2. O2 é o aceitador final de elétrons (externo, inorgânico). Captura grande quantidade de energia de glicose em ATP via formação de gradiente de prótons e ATP sintase = quimiosmose.

6. Respiração anaeróbica

7. Processos anaeróbicos: glicólise, fermentação, respiração anaeróbica

8. Processos aeróbicos: respiração aeróbica

II. Metabolismo de carboidratos e produção de energia em quimioheterotróficos

A. A oxidação (remoção de elétrons) da glicose (uma molécula reduzida) libera energia que pode ser usada para a síntese de ATP e formação de gradiente de íons. Essas fontes de energia potencial são então usadas para fazer "trabalho" celular, por exemplo, biossíntese / anabolismo, transporte ativo, motilidade.

1. Quimioheterotróficos catabolizam (degradam) carboidratos por meio da glicólise, fermentação e respiração aeróbica. Os procariontes também podem realizar respiração anaeróbica

B. Glicólise: primeira etapa na liberação de energia (via Embden-Meyerhof)

1. Grego: “glico” = doce “lise” = dissolução “quebra de açúcar”

2. Uma molécula de glicose "quebrada" em 2 moléculas de piruvato (com síntese de ATP)

3. A glicose é transportada pela primeira vez para a célula através da membrana celular

uma. em “entéricos” (Enterobacteriaceae, inclui E. coli e primos) por translocação de grupo, o sistema fosfoenol transferase (PEP). A glicose é fosforilada à medida que atravessa a membrana celular.

b. se a glicose não for fosforilada ao atravessar a membrana celular, ela interage com a hexoquinase e ATP para produzir glicose-6-P

c. a membrana celular é altamente impermeável à maioria dos compostos fosforilados, de modo que os fosfatos de açúcar ficam presos na célula.

4. Por meio de várias etapas (10 etapas envolvendo 10 enzimas no citoplasma), a glicose é convertida em 2 moléculas de piruvato. Não O2 necessário (processo anaeróbico; pode prosseguir na presença de O2).

Veja os diagramas da placa / Ppt

2ATP 2 Pi 2ADP

10 etapas catalisadas por enzima

glicose -> ---> ----> -----> ----> -----> 2 x piruvato + 4 ATP (via fosforilação em nível de substrato)

6C 3C

2NAD + 2 NADH + H +

(outros açúcares podem entrar no caminho)

5. Ganho líquido de uma molécula de glicose via glicólise:

2 (NADH + H +)

2 ATP

2 piruvato (molécula ainda de alta energia)

6. Glicólise: oxidação da glicose (remoção de elétrons) a piruvato (2 moléculas) com síntese de ATP (via fosforilação em nível de substrato) e redução de NAD + a NADH.

7. Fosforilação em nível de substrato: exemplos

uma. Fosfato transferido de ATP para intermediário de glicólise

b. Fosfatos citoplasmáticos transferidos para intermediários durante a oxidação

c. Transferência de fosfato de alta energia do intermediário para o ADP formando ATP.

Fermentação: A “vida na ausência de ar” de Pasteur. Oxida o NADH produzido durante a glicólise

1. Quando a vida evoluiu pela primeira vez na Terra, a atmosfera era anaeróbica (sem O2)

2. A glicólise pode produzir pequenas quantidades de ATP

3. Problema: a glicólise requer NAD + oxidado. Durante a glicólise, o NAD + é reduzido a NADH. Quando a célula usa todo o NAD +, a glicólise para; nenhuma energia produzida, a célula pode morrer.

4. Solução: use uma molécula orgânica interna para aceitar elétrons do NADH, para regenerar o NAD + oxidado.

5. Duas definições de fermentação:

uma. metabolismo anaeróbico do piruvato produzido na glicólise

b. vias oxidativas nas quais os compostos orgânicos atuam como aceitadores e doadores de elétrons. Energia é liberada de açúcares ou outras moléculas orgânicas na ausência de um aceitador de elétrons (externo) adicionado.

6. Muitas vias de fermentação diferentes envolvendo diferentes enzimas, resultando em diferentes produtos finais.

uma. Nomes de vias de fermentação freqüentemente baseados em produtos finais.

b. Normalmente, um organismo possui enzimas para apenas uma via. ex bactérias de ácido láctico, bactérias de ácido propiônico, levedura (fermentação alcoólica)

c. exemplos de diferentes produtos finais da via de fermentação glicose (ou outros açúcares), ver texto ou diagramas em PowerPoint glicólise ácido lático ferm homolático

algum Strept., piruvato ----- fermentação butírico-butílico-> ácido butírico, butanol,

Lactobacillus isopropanol, etanol, CO2

Clostridium tetani, botulinum

etanol, CO2, ferm alcoólico

levedura ex Saccharomyces

pão, vinho, combustível

fermentação de butanodiol

butilenoglicol, CO2 (Teste de VP)

fermentação de ácido misto fermentação propiônica Klebsiella pneumonia

ácidos acético, succínico, láctico Enterobacter aerogenes

etanol, CO2 ácido propiônico, ácido acético, CO2, H2

E. coli, Salmonella, Shigella Propionibacterium (acne, queijo suíço)

Proteus, Yersinia

7. Fermentação de ácido láctico: (bactérias de ácido láctico ex Streptococcus. Lactobacillus) ver quadro ou diagramas de texto

glicose

NADH NAD +

piruvato -------------------> ácido láctico

lactato desidrogenase

8. Fermentação alcoólica: (ex levedura, espécie Saccharomyces) ver quadro ou diagramas de texto

glicose 6C ------------------> piruvato 3C

2 NAD + 2 NADH ------> 2 CO2 2NAD + 2 etanol 2C

9. Os intermediários / produtos finais da fermentação podem ser detectados e usados ​​para identificar o organismo específico (diagnóstico, "testes bioquímicos" que usaremos em laboratório)

10. Problemas com fermentação

uma. produtos residuais de alta energia (muita energia ainda armazenada nos produtos finais)

b. produtos finais frequentemente tóxicos (ácidos, álcoois)

c. solução: respiração ....

Respiração : ver diagramas de texto / ppt

I. Primeiro destino do piruvato: fermentação

II. Segundo destino do piruvato: respiração

A. Respiração: uso da cadeia de transporte de elétrons (ETC) em processos oxidativos (aeróbio e anaeróbio)

B. Respiração aeróbica: oxidação completa de glicose em CO2 e H2O com síntese de ATP (nível de substrato e fosforilação oxidativa via mecanismo quimiosmótico). O2 atua como aceptor terminal de elétrons de ETC. Aumenta muito a quantidade de ATP sintetizado por molécula de glicose

1. fermentação = 2 ATP / glicose vs respiração aeróbica = aprox. 38 ATP / glicose

C. História: anaeróbio da atmosfera da Terra primitiva.

1. evolução dos anéis de porfirina -> evolução das moléculas de clorofila e citocromos

-primeira fotossíntese realizada por bactérias = “fotossíntese anoxigênica”; não O2 liberou bactérias fotossintéticas ex roxas e verdes, use bacterioclorofilas

2. As moléculas de clorofila permitiram a evolução da fotossíntese oxigenada por cianobactérias primitivas

6CO2+ 6H2O - luz / clorofila -> C6H12O6+ 6 O2

- os níveis de O2 aumentam na atmosfera, criando um ambiente aeróbico

3. evolução dos citocromos -> cadeias de transporte de elétrons (ETC)

- evolução da respiração anaeróbica (outras moléculas além de O2 são usados ​​como receptores de elétrons terminais ex nitrato

- ETC + O2-> evolução da respiração aeróbia O2 usado como receptor de elétron terminal

D. Ciclo do ácido tricarboxílico = Ciclo de Krebs = Ciclo do ácido cítrico. Via principal de geração de ATP em organismos aeróbios. FIG ___

-piruvato / acetil CoA é oxidado de maneira cíclica, gerando NADH e FADH2

1. enzimas no citoplasma

2. evolução: a primeira parte do ciclo (através do alfa-cetoglutarato) provavelmente evoluiu antes do O2 presente na atmosfera. A coenzima A é uma molécula antiga, um ribonucleotídeo (possivelmente reflete o mundo antigo quando se pensava que as moléculas de RNA agiam como catalisadores biológicos = "ribozimas" = catalisadores de RNA)

3. Mesmo os anaeróbios estritos têm a maioria das enzimas do ciclo do TCA; intermediários usados ​​na biossíntese.

4. Complexo Piruvato Desidrogenase (PDC): descarboxilação oxidativa do piruvato com adição de CoA; ligação irreversível entre glicólise e TCA. –Ver diagramas de texto / Ppt

NAD + PDC NADH

(x2 por glicose) piruvato -------------------------------> acetil CoA + CO2

3C Coenzima A 2C

5. acetil CoA (2C) entra no ciclo de TCA combinando-se com ácido oxaloacético (4C) formando citrato (6C) (ver diagrama)

uma. para cada "volta" do ciclo, 2 carbonos são liberados como CO2

b. ácido oxaloacético (4C) regenerado que pode se combinar com outro acetil CoA (ciclo)

-ver diagramas de texto / Ppt

acetil CoA

Citrato de NADH oxaloacetato

NAD + NAD +

FADH2 CO2

FAD NADH

CO2

ADP GTP NAD +

PIB NADH

ATP

6. Resumo do ciclo de Krebs

uma. por turno: 3NAD + são reduzidos a 3 (NADH + H +)

1 FAD reduzido para FADH2

1 ATP sintetizado (fosforilação em nível de substrato via GTP)

2 CO2 liberado (produto final da respiração aeróbica)

d. por molécula de glicose, o ciclo de TCA "girará" duas vezes

7. Cada NADH gerará 3 ATP via ETC; cada FADH2 irá gerar 2 ATP via ETC

8. Os intermediários TCA são usados ​​para a biossíntese: alfa-cetoglutarato-> aminoácidos;

succinil CoA-> síntese de porfirina; oxaloacetato-> aminoácidos

E. Cadeia de transporte de elétrons, respiração, quimiosmose e síntese de ATP

1. transportadores de elétrons localizados na membrana celular de procariotos e na membrana mitocondrial interna de eucariotos

uma. citocromos: proteínas com anéis de porfirina com ferro = heme: Fe3 + + elétron <-> Fe2 +

-diferentes tipos ex a1, a2, b1, c

- alguns organismos não podem sintetizar anéis heme ex Streptococcus

b. proteínas de enxofre ex ferrodoxina

c. quinonas lipossolúveis; Coenzima Q

2. 2 funções do ETC:

uma. para aceitar elétrons de e-doadores e transferir para e-aceitantes

b. usar a energia liberada da transferência de elétrons para criar gradiente de prótons através da membrana (fonte de energia potencial) "força motriz de prótons"

c. alguns portadores aceitam átomos de H (H + + elétron); outros aceitam apenas elétrons. Resultado: H + é “bombeado” através da membrana, criando gradiente de prótons

3. respiração aeróbia: aceitador de elétrons terminal = externo, O inorgânico2

2 e- + 2H + +1/2 O2= H2O (produto final da respiração aeróbica)

4. Quimiosmose: Gradiente de prótons através da membrana usada para realizar trabalho celular; ex usado para conduzir a síntese de ATP via ATP sintase na membrana fig ___

uma. à medida que os prótons fluem de volta através da membrana através da ATP sintase, o ADP é fosforilado, produzindo ATP

5. fosforilação oxidativa: “A produção de ATP usando energia derivada de reações redox de um ETC“

-comparar com ... fosforilação em nível de substrato: a formação de ATP pela transferência direta de um grupo fosfato para ADP de um substrato intermediário no catabolismo

Respiração aeróbia resumida: C6H12O6 + 6O2-----> 6CO2+ 6H2O + (36- 38) ATP + calor

Grande visão geral da respiração aeróbica: elétrons de alta energia da glicose são arrancados, carregados por NADH e FADH2 para a membrana celular onde o ETC está localizado, transmitidos para baixo ETC, perdem energia, energia usada para bombear prótons através da membrana celular criando PROTON GRADIENT, que é usado para conduzir ATP SYNTHESIS via ATP SYNTHASE.

6. Respiração anaeróbica: (apenas procariotos) -spiração anaeróbica. Respiração usando molécula diferente de O2 como aceitador de elétrons terminal no final de ETC, ex NO3 -nitrato usado como doador terminal e, reduzido a nitrito ou possivelmente N2

-comendo nitratos / nitritos (conservantes de alimentos) -> nitritos produzidos no intestino de ex E.coli redução de nitrato, nitrito-> nitrosaminas-> cancerígeno suspeito, predispõe ao câncer de cólon? Nitratos e metemogloninemia?

ex Sulfatos reduzidos a H2S

-------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------

Comparando fermentação, respiração aeróbica, respiração anaeróbica

O2 necessários ATP produzidos aceitadores de elétrons finais?

Fermentação NO 2ATP / glicose

Aerobic resp. SIM aprox. 38 bactérias ATP / glicose

Anaero. resp NO> 2 ATP; <38 ATP

Notas: -glicólise é uma via comum para o metabolismo aeróbio e anaeróbio

-organismos crescem mais rápido via respiração aeróbica do que por fermentação (maior rendimento de ATP / glicose)

- note que o tecido muscular de mamíferos reverte para a fermentação de ácido láctico quando O2 níveis baixos de ácido láctico (exercício pesado) levados pelo sangue para o fígado, onde é alterado de volta para glicose

-glicólise pode operar anaerobicamente se as vias de fermentação estiverem disponíveis

- em organismos que realizam respiração aeróbica, mas não respiração anaeróbica, tanto o ciclo de Krebs quanto a ETC são inibidos pela falta de O2

- na respiração aeróbica, 60% da energia da glicose é perdida na forma de calor

III. Biossíntese / anabolismo

A. Muitos dos intermediários da glicólise, o ciclo de Kreb, são precursores importantes nas reações biossintéticas / anabólicas

1 .. exemplos: intermediários do ciclo de Krebs

alfa-cetoglutarato -> aminoácidos succinil CoA -> porfirinas

OAA -> aminoácidos

2. “Krebs prep”: acetil CoA -> ácidos graxos / lipídios

3. Glicólise: piruvato -> aminoácidos

B. Para muitas reações biossintéticas, elétrons de alta energia são necessários para reduzir as moléculas. Esses elétrons de alta energia são fornecidos pelo NADPH (semelhante ao NADH, exceto um grupo fosfato adicional)

O NADPH é produzido durante a Via das Pentoses Fosfato. Esta via usa glicose-6-P da glicólise e produz NADPH, ribose-5-P

Via IV Entner Doudoroff; alternativa para a via Embden –Meyerhof

V. Fotossíntese:

A. Fotossíntese oxigenada: cianobactérias, plantas verdes chl a (Fotoautotróficos)

6CO2 + 6 H2O -> luz / chla -> C6H12O6 + 6 O2

B. Fotossíntese anoxigênica (apenas procariotos)

por exemplo. 6CO2 + 6H2S-> bacterioclorofila / luz -> C6H12O6+ 6 enxofre (enxofre elementar, aprox)

VI. : Ciclo do nitrogênio:

1. Fixação de nitrogênio: algumas bactérias podem quebrar a ligação covalente tripla do N2, reduzir e produzir NH3 amônia-> amônio NH4 + que pode então ser usado pelas plantas para sintetizar aminoácidos. Rizóbio simbiótico e leguminosas. nódulos radiculares, relações simbióticas. Rhizobium converte N2 em amônia / amônio que planta pode usar para sintetizar aminoácidos. Bactérias fixadoras de nitrogênio também incluem cianobactérias, Azotobacter, Bacillus e Clostridium, bactérias nitrificantes, bactérias desnitrificantes

2. Nitrificação: amônio-> nitrito / nitrato

3. Desnitrificação-: nitrato-> N2, perda de “nitrogênio utilizável”. Os agricultores não desejam que ocorra a desnitrificação, embora seja útil no tratamento de esgoto (por quê?)


Metabolismo bacteriano

Como afirmado acima, bactérias heterotróficas (ou organotróficas) requerem moléculas orgânicas para fornecer seu carbono e energia. As reações catabólicas geradoras de energia podem ser de muitos tipos diferentes, embora todas envolvam reações de transferência de elétrons nas quais o movimento de um elétron de uma molécula para outra é acoplado a uma reação de captura de energia que produz ATP. Algumas bactérias heterotróficas podem metabolizar açúcares ou carboidratos complexos para produzir energia. Essas bactérias devem produzir uma série de proteínas específicas, incluindo enzimas que degradam os polissacarídeos em suas unidades de açúcar constituintes, um sistema de transporte para acumular o açúcar dentro da célula e enzimas para converter o açúcar em um dos intermediários centrais do metabolismo, como glicose-6-fosfato. Existem várias vias centrais para a utilização de carboidratos, incluindo a via Embden-Meyerhof da glicólise e a via da pentose fosfato, ambas também presentes em células eucarióticas. Algumas bactérias possuem a via Entner-Doudoroff, que converte a glicose principalmente em piruvato, bem como outras vias que realizam a conversão da glicose em compostos menores com menos etapas catalisadas por enzimas.

O metabolismo do açúcar produz energia para a célula por meio de dois processos diferentes, fermentação e respiração. A fermentação é um processo anaeróbico que ocorre na ausência de qualquer aceitador externo de elétrons. O composto orgânico, como um açúcar ou aminoácido, é dividido em moléculas orgânicas menores, que aceitam os elétrons que foram liberados durante a quebra da fonte de energia. Essas reações catabólicas incluem algumas etapas que resultam na formação direta de ATP. Quando a glicose é quebrada em ácido láctico, como ocorre em alguns Lactococcus e Lactobacillus espécies, bem como em células musculares em eucariotos superiores, cada molécula de glicose produz apenas duas moléculas de ATP, e quantidades consideráveis ​​de glicose devem ser degradadas para fornecer energia suficiente para o crescimento bacteriano. Como as moléculas orgânicas são apenas parcialmente oxidadas durante a fermentação, o crescimento das bactérias fermentativas resulta na produção de grandes quantidades de produtos orgânicos finais e uma saída relativamente pequena de energia por molécula de glicose consumida. Poucas bactérias produzem apenas ácido láctico, que é bastante tóxico para as bactérias e limita o crescimento de uma colônia. Uma variedade de vias de fermentação adicionais são usadas por bactérias específicas para quebrar a glicose. Os produtos finais característicos dessas vias auxiliam na identificação das bactérias. Esses produtos finais são frequentemente menos tóxicos do que o ácido láctico ou são formados com o aproveitamento de energia metabólica adicional. Por exemplo, os produtos da fermentação de ácido misto em E. coli incluem ácido láctico, ácido succínico, ácido acético, ácido fórmico, álcool etílico, dióxido de carbono e gás hidrogênio. Enterobacter aerogenes produz a maior parte do mesmo conjunto de produtos de fermentação, bem como grandes quantidades de 2,3-butilenoglicol, que não é ácido e permite maior crescimento bacteriano.

Há consideravelmente mais energia disponível para a célula a partir da respiração, um processo no qual os elétrons das moléculas de açúcar são transferidos não para outra molécula orgânica, mas para uma molécula inorgânica. O processo respiratório mais conhecido (respiração aeróbica) usa o oxigênio como o aceptor final de elétrons. O açúcar é completamente decomposto em dióxido de carbono e água, produzindo um máximo de 38 moléculas de ATP por molécula de glicose. Os elétrons são transferidos para o oxigênio usando a cadeia de transporte de elétrons, um sistema de enzimas e cofatores localizados na membrana celular e dispostos de forma que a passagem dos elétrons pela cadeia seja acoplada ao movimento dos prótons (íons de hidrogênio) através da membrana e para fora da a célula. O transporte de elétrons induz o movimento de íons de hidrogênio com carga positiva para o exterior da célula e íons com carga negativa para o seu interior. Este gradiente de íons resulta na acidificação do meio externo e uma membrana plasmática energizada com uma carga elétrica de 150 a 200 milivolts. A geração de gradientes de íons, incluindo esta força protonmotriz (gradiente de prótons), é um aspecto comum de geração e armazenamento de energia em todos os organismos vivos. O gradiente de prótons é usado diretamente pela célula para muitos processos, incluindo o transporte ativo de nutrientes e a rotação dos flagelos. Os prótons também podem se mover do exterior da célula para o citoplasma, passando por uma enzima de membrana chamada F1F0- ATPase de translocação de prótons, que acopla esse movimento de prótons à síntese de ATP em um processo idêntico ao que ocorre na mitocôndria de células eucarióticas (Vejo metabolismo: A combustão de materiais alimentares).

As bactérias que são capazes de usar a respiração produzem muito mais energia por molécula de açúcar do que as células fermentativas, porque a oxidação completa (quebra) da fonte de energia permite a extração completa de toda a energia disponível, conforme mostrado pelo rendimento substancialmente maior de ATP para a respiração organismos do que para fermentar bactérias. Os organismos que respiram obtêm uma maior produção de material celular usando uma determinada quantidade de nutrientes e também geram menos produtos finais tóxicos. A solubilidade do oxigênio na água é limitada, entretanto, e o crescimento e a sobrevivência das populações de bactérias aeróbias são diretamente proporcionais ao suprimento de oxigênio disponível. Suprimentos contínuos de oxigênio estão disponíveis apenas para bactérias que entram em contato com o ar, como ocorre quando as bactérias são capazes de flutuar em uma superfície que as expõe ao ar ou quando o meio em que as bactérias vivem é agitado vigorosamente.

A respiração também pode ocorrer em condições anaeróbicas por processos chamados de respiração anaeróbica, em que o aceptor de elétrons final é uma molécula inorgânica, como o nitrato (NO3 -), nitrito (NO2 -), sulfato (SO4 2−), ou dióxido de carbono (CO2) Os rendimentos de energia disponíveis para a célula usando esses aceitadores são menores do que na respiração com oxigênio - muito menores no caso de sulfato e dióxido de carbono - mas ainda são substancialmente maiores do que os rendimentos de energia disponíveis na fermentação. A capacidade de algumas bactérias de usar moléculas inorgânicas na respiração anaeróbia pode ter um significado ambiental. E. coli pode usar oxigênio, nitrato ou nitrito como um aceitador de elétrons, e Pseudomonas stutzeri é de grande importância global por sua atividade na desnitrificação, na conversão de nitrato em nitrito e dinitrogênio gasoso (N2). Desulfovibrio e Desulfuromonas reduzir o sulfato e o enxofre elementar (S), respectivamente, produzindo sulfeto (S 2−), e a bactéria Acetobacterium woodii e archaea metanogênica, como Methanothermobacter thermautotrophicus, reduzem o dióxido de carbono a acetato e metano, respectivamente. O Archaea normalmente usa hidrogênio como um doador de elétrons com dióxido de carbono como um aceitador de elétrons para produzir metano ou com sulfato como um aceitador de elétrons para produzir sulfeto.


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Resultados

Uma filogenia de referência robusta para o CPR

Reunimos um grande conjunto de genomas curados de bactérias CPR de diversos ambientes, incluindo sequências publicadas anteriormente e recentemente montadas (a seção “Materiais e métodos”). A filtração de qualidade deste genoma com curadoria definida em ≥ 70% de integridade e ≤ 10% de contaminação e subsequente desreplicação gerou um conjunto não redundante de 991 genomas para análise filogenética e metabólica downstream (arquivo adicional 1, Tabela S1). Para melhorar a recuperação de marcadores filogenéticos do conjunto coletado de genomas, combinamos a visualização de bitscores HMM com uma abordagem filogenética para definir limiares personalizados e sensíveis para dois conjuntos independentes de marcadores compostos por 16 proteínas ribossômicas sintênicas (rp16) e as duas subunidades de RNA polimerase (RNAp) (a seção “Materiais e métodos” Arquivo adicional 2, Fig. S1). As filogenias baseadas nestes dois conjuntos de marcadores foram geralmente congruentes para relacionamentos profundos dentro do CPR, com ambas as árvores apoiando a distinção de CPR do grupo externo bacteriano e a monofilia dos microgenomatos e Parcubacteria superphyla, respectivamente (Fig. 1a Arquivo adicional 2, Fig. S2). Alguns clados também foram suportados pela ausência de proteínas ribossômicas específicas - os microgenomatos, junto com as Dojkabacteria e Katanobacteria, não tinham a proteína ribossômica L9 (rpL9), enquanto um subconjunto de Parcubacteria não tinha a proteína ribossômica L1 (rpL1), conforme observado anteriormente [1 ] Nossos resultados também sugeriram a presença de quatro subgrupos geralmente bem suportados (≥ 95% bootstrap ultrarrápido em três dos quatro casos), subgrupos monofiléticos dentro das Parcubacteria (Fig. 1a, Parcubacteria 1–4). Embora as relações internas entre esses subgrupos variassem ligeiramente entre as árvores (Arquivo adicional 2, Fig. S2), em ambos os casos, Parcubacteria 1 (compreendendo 9 linhagens) foi o clado mais profundo, enquanto Parcubacteria 4 (10 linhagens) foi o mais superficial (Fig. 1a). Dez outras linhagens de Parcubacteria formaram clados parafiléticos fora desses subgrupos. Também mostramos que Dojkabacteria (WS6), Katanobacteria (WWE3), Peregrinibacteria, Kazanbacteria e Berkelbacteria estão entre os clados de enraizamento mais profundo fora dos superfilos estabelecidos (Fig. 1a).

Relações filogenéticas e similaridade metabólica entre bactérias Candidato Phyla Radiation. uma Árvore de máxima verossimilhança com base no conjunto concatenado de 16 proteínas ribossômicas (1427 aminoácidos, modelo LG + R10). A barra de escala representa o número médio de substituições por site. Os subgrupos monofiléticos dentro da Parcubacteria também suportados na árvore da RNA polimerase concatenada são indicados como Parcubacteria 1-4. A presença / ausência de um subconjunto de características metabólicas direcionadas é indicada como anéis concêntricos. Abreviaturas: aldo., Aldolase desidr., Desidrogenase, PRPP, fosforibosilpirofosfato, PEP, fosfoenolpiruvato PFOR, piruvato: ferredoxina oxidoredutase acetiltrans., Acetiltransferase Hyd, hidrogenase. Árvores totalmente anotadas com todas as linhagens incluídas estão disponíveis no arquivo adicional 2, Fig. S2. b Análise de coordenadas principais que descreve a similaridade entre plataformas metabólicas de linhagens de CPR com 8 ou mais genomas representativos

Bactérias CPR codificam repertórios metabólicos variáveis ​​e sobrepostos

Em seguida, alavancamos a árvore de referência robusta do CPR para avaliar a distribuição e as combinações de capacidades através da radiação. Embora as bactérias da RCP não possuam algumas capacidades biossintéticas centrais, elas de fato possuem inúmeras capacidades metabólicas envolvidas no ciclo do carbono, hidrogênio e possivelmente enxofre e nitrogênio [5, 12, 18, 20]. Nós nos concentramos nessas características para nossa análise subsequente, raciocinando que são mais propensas a impactar a capacidade das bactérias CPR de derivar energia de compostos orgânicos e contribuir para transformações biogeoquímicas em conjunto com seus hospedeiros e outros membros da comunidade. Para superar os desafios inerentes à anotação metabólica de linhagens divergentes e minimizar a chance de falsos negativos, estendemos nossa abordagem de limite de HMM personalizado para o conjunto selecionado de características biogeoquimicamente relevantes (a seção "Materiais e métodos" Arquivo adicional 2, Fig. S3 Adicional arquivo 3, Tabela S2) e mapeou os perfis binários de presença / ausência resultantes para funcionalidades específicas na árvore rp16 reconstruída. Olhando através das características selecionadas, observamos um alto grau de variação nos repertórios gerais de linhagens dentro do CPR, incluindo alguns com complementos metabólicos extremamente mínimos, como Dojkabacteria e Gracilibacteria. Isso é consistente com as observações de estudos genômicos dessas linhagens [12], bem como com os insights mais recentes examinando proteomas inteiros [15].

Uma importante questão em aberto é se os clados de bactérias CPR dentro de amplos agrupamentos filogenéticos possuem combinações semelhantes de capacidades metabólicas. Para investigar isso, usamos as distribuições das características-alvo para calcular a frequência com que cada característica foi encontrada dentro das linhagens. Em seguida, geramos uma matriz de distância a partir dos resultados e realizamos uma análise de coordenadas principais para visualizar o agrupamento de linhagens com base na similaridade de suas plataformas metabólicas gerais (Fig. 1b, a seção “Materiais e métodos”). Raciocinamos que os genes ausentes devido à incompletude do genoma poderiam impactar o agrupamento, particularmente para pequenas linhagens com apenas vários membros. Assim, restringimos a análise aos grupos com pelo menos 8 genomas membros. Os resultados sugerem que as linhagens membros dentro de alguns amplos agrupamentos filogenéticos são metabolicamente semelhantes (por exemplo, Parcubacteria 3 e 4), mas outras se agrupam mais intimamente com linhagens que estão distantemente relacionadas. Por exemplo, as linhagens dentro dos Microgenomates e Parcubacteria 1 foram altamente dispersas ao longo dos eixos de variação (Fig. 1b), sugerindo que os grupos de membros codificam combinações altamente variáveis ​​de características.

Genes metabólicos funcionalmente ligados exibem diferentes perfis evolutivos

A observação de que as distribuições de características são variáveis ​​e potencialmente dissociadas da relação filogenética levanta a possibilidade de que padrões mais complexos e específicos de enzimas possam estar subjacentes à diversidade metabólica no RCP. Para resolver isso, utilizamos distribuições de características para calcular duas métricas na árvore de referência - a primeira para quantificar o comprimento médio dos ramos dos clados em que uma característica é conservada (profundidade filogenética) e a segunda para analisar a distribuição da característica, relacionada ao número de ganhos / perdas de uma característica binária em uma árvore (a seção “Materiais e métodos”) [22]. Geralmente, as características com uma profundidade filogenética alta correspondem àquelas que são conservadas em clados de enraizamento mais profundo, enquanto as características com profundidade inferior correspondem àquelas que ocorrem principalmente entre os clados rasos. Da mesma forma, alta patchiness é esperada quando um dado traço é mais aleatoriamente disperso em um clado, enquanto traços com baixos escores de patchiness correspondem àqueles que são altamente conservados dentro dos grupos. Essas duas métricas são, portanto, complementares e foram integradas para criar um “perfil evolutivo” para cada característica. Entre as bactérias CPR, observamos que um aumento na profundidade filogenética geralmente se correlaciona com uma diminuição na irregularidade (Fig. 2a). Traços de alta profundidade também corresponderam a famílias de proteínas maiores mais frequentemente observadas ao longo da radiação (tamanho da família), embora várias famílias de proteínas menores (fosfato acetiltransferase, AMP fosforilase, RuBisCO) alcançaram profundidades filogenéticas relativamente altas porque foram conservadas em clados de enraizamento profundo como o Dojkabacteria and Peregrinibacteria. Por outro lado, o metabolismo do hidrogênio / enxofre, o metabolismo do acetato / lactato e a via da pentose fosfato oxidativa exibiram reticulação relativamente alta e baixa profundidade filogenética, consistente com sua distribuição esparsa, mas também ampla em grupos distantemente relacionados (Fig. 2). Curiosamente, algumas características exibiram uma profundidade filogenética relativamente baixa, mas foram distribuídas de forma menos fragmentada do que seria previsto a partir da tendência geral (por exemplo, genes envolvidos no metabolismo aeróbio).

Traços metabólicos codificados por bactérias CPR exibem perfis evolutivos variados, incluindo aqueles na mesma via (por exemplo, genes de glicólise). uma Perfis evolutivos gerados a partir da profundidade filogenética e fragmentação das distribuições de genes sobre a topologia rp16. Cada ponto representa um gene metabólico sombreado para corresponder à categoria / via funcional em b, esquemático representando uma plataforma metabólica generalizada para bactérias RCP

Como nossa análise se baseou em genomas preliminares (≥ 70% dos marcadores do genoma presentes), é possível que a incompletude do genoma impactou as estimativas de presença / ausência de genes metabólicos.Raciocinamos que a métrica de patchiness em particular seria sensível a esse problema, uma vez que é calculada (ao contrário da métrica de profundidade filogenética) usando o número de transições de estado de caracteres binários na árvore. Para abordar essa possibilidade, realizamos uma análise de sensibilidade de parâmetro que testou a robustez dos escores de patchiness para a integridade do genoma. Repetimos a subamostragem do genoma definido em limiares crescentes de completude e recalculamos a fragmentação do traço em uma versão podada da árvore de referência (a seção "Materiais e métodos"), observando apenas diminuições modestas na fragmentação para componentes individuais das vias alvo como genoma completude aumentou para 95% (arquivo adicional 2, Fig. S4a). Enzimas glicolíticas específicas mostraram um padrão semelhante, com exceção da triose fosfato isomerase (TIM), gliceraldeído 3-fosfato (GADPH) e fosfoglicerato quinase (PGK), que já eram essencialmente universais em bactérias CPR no limite de completude mais baixo (Fig. 3b Arquivo adicional 2, Figura S4ab). Tomados em conjunto, esses resultados sugerem que, embora a incompletude do genoma provavelmente tenha impacto sobre os cálculos de fragmentação em uma pequena extensão, nossas observações são principalmente devido a um sinal biológico, não metodológico.

Padrões de distribuição e árvores gênicas para enzimas glicolíticas em todo o CPR. uma Perfis evolutivos baseados em manchas e profundidade filogenética e b perfis de presença / ausência na árvore rp16. c Filogenias moleculares específicas de proteínas para triose fosfato isomerase (tim) e enolase (eno). Abreviaturas: hex, hexoquinase pfk, fosfofrutocinase pk, piruvato quinase fba, frutose bifosfato aldolase eno, enolase pgi, fosfoglucose isomerase pgm, fosfoglicerato mutase tim, triose fosfato isomerase-fosfato-fosfato 3 fosfoglicerase fosfoglicerase fosfoglicerase fosfoglicerase 3 fosfato-fosfato Glicerase fosfoglicerase fosfato 3 fosfoglicerase fosfoglicerase fosfato 3 fosfato-glicerase fosfoglicerase fosfato 3 fosfato gliceraldeidrase-fosfato gliceraldeidrase 3 fosfoglicerase fosfato 3 fosfato gliceraldeidrase. PEP, fosfoenolpiruvato PPP, via da pentose fosfato. Barras de escala representam o número médio de substituições por site

Surpreendentemente, os genes metabólicos dentro da mesma via frequentemente exibiam perfis evolutivos díspares - por exemplo, as enzimas envolvidas na glicólise exibiam uma ampla gama de profundidade e desagregação (Fig. 2a). Padrões semelhantes foram observados para a via de resgate de nucleotídeos e a via não oxidativa da pentose fosfato (Fig. 2a). Essas observações podem sugerir que as histórias evolutivas das enzimas componentes dessas vias são desacopladas especificamente, que os traços com alta profundidade filogenética e baixa fragmentação são provavelmente antigos e conservados (baixa perda), enquanto aqueles com menor profundidade e maior fragmentação são mais propensos a ter foi impactado pela perda e / ou transferência horizontal de genes. Para testar essas hipóteses, investigamos dois casos mais detalhadamente - primeiro, glicólise, como um exemplo de uma via central com uma ampla gama de profundidade filogenética e irregularidade entre as enzimas componentes e, segundo, hidrogenases NiFe, uma característica acessória com alta fragmentação e baixa profundidade.

Árvores de genes para enzimas glicolíticas refletem diferentes padrões de perda e transferência de genes

Examinamos primeiro a glicólise, observando que três enzimas da parte central da via - TIM, GAPDH e PGK - foram encontradas em quase todas as bactérias de RCP com pouca ou nenhuma mancha (Fig. 3a). Com a possível exceção de formas ultra-reduzidas como a Gracilibacteria, que é representada por um genoma curado completo que carece completamente da via de glicólise [23], a ausência dessas enzimas em um número muito pequeno de genomas é provavelmente devido à falta de genoma em formação. Um segundo grupo de enzimas, composto de frutose bifosfato aldolase (FBA), enolase (ENO) e fosfoglucose isomerase (PGI), foi geralmente distribuído de forma mais irregular entre as bactérias CPR e ausente em algumas linhagens. A fosfoglicerato mutase (PGM), responsável por converter o glicerato 1,3-P2 em glicerato 2P na glicólise inferior, caiu entre os dois grupos - embora presente em clados de enraizamento profundo (portanto, uma profundidade filogenética alta), está ausente em vários clados rasos de Parcubacteria, possivelmente porque essas formas eram muito divergentes para serem recuperadas com o limiar HMM manual. Finalmente, várias enzimas, incluindo glucoquinase / hexoquinase, fosfofrutocinase (PFK) e piruvato quinase, exibiram perfis altamente desiguais e com menor profundidade entre as linhagens de RCP. Notavelmente, acredita-se que essas enzimas catalisem reações irreversíveis e, portanto, atuem como importantes locais de regulação do fluxo metabólico [5, 24]. Em particular, glucoquinase / hexoquinase e PFK foram encontrados muito raramente em bactérias CPR, embora muitos tenham o potencial de contornar PFK usando um shunt metabólico através da via não oxidativa da pentose fosfato (Fig. 3b) [12]. Para confirmar este resultado, também pesquisamos genomas por formas alternativas de PFK, descobrindo que, embora algumas bactérias CPR codifiquem proteínas da família ROK (repressor, open reading frame, quinase) (TIGR00744), não poderíamos estabelecer relações filogenéticas próximas com membros da família funcionando como glucocinases putativas. Da mesma forma, não encontramos evidências para as versões alternativas de glucoquinase / fosfofrutocinase dependente de ADP empregadas nas vias glicolíticas modificadas de algumas arquéias (PF04587) [25].

Para testar ainda mais o impacto da incompletude do genoma na aparente irregularidade das enzimas glicolíticas no CPR e investigar se esse padrão é único, realizamos uma análise comparativa de outros principais filos bacterianos. Raciocinamos que, se a alta fragmentação da glicólise em bactérias de RCP se deve principalmente à incompletude do genoma, as enzimas desses organismos deveriam ter irregularidades semelhantes às de suas contrapartes em genomas de outros grupos com plataformas metabólicas mais típicas. Ao contrário, se nossos resultados iniciais forem indicativos de um verdadeiro sinal biológico, esperaríamos que as enzimas das bactérias CPR apresentassem uma desagregação consistentemente maior do que a observada em outros filos bacterianos. Reunimos vários milhares de genomas de metagenomas que foram montados e agrupados com métodos semelhantes aos usados ​​para reconstruir genomas de bactérias CPR, correspondendo a grandes grupos filogenéticos - Proteobacteria (n = 1090), Firmicutes (n = 680), e Bacteroidetes (n = 578) (a seção “Materiais e métodos”). Para garantir a comparabilidade de nossos resultados, usamos a mesma metodologia para avaliação da integridade do genoma, anotação metabólica e análise da glicólise do RCP. Nós mostramos que as enzimas da glicólise individuais de bactérias CPR geralmente atingem a maior distribuição entre as linhagens examinadas, particularmente para as enzimas nos terminais da via (arquivo adicional 2, Fig. S4c). As exceções incluem as três enzimas da glicólise que consideramos ser um núcleo, módulo essencialmente universal em todo o CPR (TIM, GAPDH e PGK) e para a enolase, onde Firmicutes também mostrou manchas significativas (arquivo adicional 2, Fig. S4c). Essas descobertas confirmam ainda que o grau de manchas observado para enzimas glicolíticas em bactérias CPR é robusto para problemas decorrentes da incompletude do genoma e é incomum nas principais linhagens bacterianas.

Para investigar quais processos específicos impactaram a evolução díspar de enzimas glicolíticas em bactérias CPR, reconstruímos filogenias de proteína única e realizamos reconciliações de árvore de espécies de genes (a seção “Materiais e métodos”). Raciocinamos que as enzimas cujas histórias evolutivas foram moldadas principalmente por transferência vertical emparelhada com perda genômica, em vez de transferência, exibiriam padrões filogenéticos aproximadamente congruentes com nossa árvore de espécies de referência resolvida, enquanto aqueles impactados por transferência horizontal (com grupos CPR ou não-CPR ) exibiria relacionamentos incongruentes. Árvores de genes para capacidades glicolíticas bem conservadas como TIM e PGK geralmente recapitulam agrupamentos filogenéticos em um nível grosseiro (Fig. 3c Arquivo adicional 2, Fig. S5). No entanto, mesmo para essas enzimas, inconsistências com a árvore de espécies estavam presentes - por exemplo, algumas sequências TIM de Microgenomates, Katanobacteria e Peregrinibacteria agrupadas com sequências de referência de arquea (Fig. 3c). Esses resultados foram replicados em vários genomas, e as associações filogenéticas de ORFs circundantes no mesmo andaime foram verificadas pelo BLAST para garantir que o andaime se originou de um organismo CPR. Da mesma forma, na filogenia da enolase, grandes aglomerados monofiléticos representando sequências de Microgenomates e Parcubacteria 1 foram resolvidos, no entanto, outras sequências de Microgenomates e muitas de Parcubacteria 3 e 4 caíram em grupos menores fragmentados que se agruparam com linhagens mais distantemente relacionadas (Fig. . 3c). Árvores de genes para outras enzimas glicolíticas exibiram uma variedade de padrões (Arquivo adicional 2, Fig. S5). No geral, as inconsistências da árvore de espécies de genes sugerem que a transferência lateral de genes, seja entre bactérias CPR e outros taxa ou entre bactérias CPR diferentes, também impactou a evolução das enzimas glicolíticas ao lado da perda de gene aparente dos perfis de presença / ausência (Fig. 3a )

Apoiando a possibilidade de transferência horizontal de genes está a observação de que várias formas distintas de enzimas estão na base das distribuições de várias funções glicolíticas. Por exemplo, recuperamos hits únicos para três HMMs individuais que representam várias versões de PGI - uma descrevendo uma versão geral de domínio cruzado (PF00342), outra uma PGI / fosfomanose isomerase bifuncional presente em algumas bactérias e arquéias (TIGR02128) [26], e, finalmente, uma enzima à base de cupina não relacionada originalmente descrita a partir de archaea (PF06560) [27, 28]. Curiosamente, todas as três enzimas estavam espalhadas pelos amplos grupos de RCP, embora muito poucos organismos de RCP (

2% dos genomas) codificava mais de uma versão. Cerca de 15 genomas, em sua maioria pertencentes à bactéria Nealson, codificam apenas a versão relacionada ao cupin. Estas sequências formam um clado irmão daqueles dos genomas de referência arquea na árvore de genes correspondente (arquivo adicional 2, Fig. S5). Sequências de organismos de RCP com maior similaridade com versões de archaeal também foram recuperadas para PGM (TIGR00306) e para TIM, embora no último caso as sequências não correspondessem a um HMM separado (arquivo adicional 2, Fig. S5). Da mesma forma, enquanto a maioria das bactérias CPR codificam uma enzima FBA classe II, algumas, particularmente Kaiserbacteria e Woesebacteria, também codificam uma enzima classe I que funciona através de um mecanismo de reação distinto [29]. Finalmente, nas reconstruções da árvore gênica para a aldolase de classe II, as sequências de bactérias CPR não parecem ser monofiléticas, com pequenos subgrupos dispersos entre sequências de outras bactérias. Tomados em conjunto, esses resultados indicam que enzimas de múltiplas origens evolutivas fundamentam as distribuições do metabolismo do carbono central e apóiam a ideia de que suas distribuições foram moldadas por episódios de transferência lateral de genes, potencialmente de bactérias não-CPR ou arquéias.

Bactérias CPR codificam formas filogeneticamente distintas de hidrogenases NiFe com contexto genômico variável

Em seguida, investigamos o impacto da transferência lateral nos metabolismos esparsamente distribuídos pelo CPR, focando nas hidrogenases NiFe como um estudo de caso devido ao seu possível papel na economia de hidrogênio e / ou fluxo de elétrons [5, 18]. A maioria das sequências de bactérias CPR foram relatadas anteriormente como pertencentes às hidrogenases do Grupo 3b, enzimas citoplasmáticas que podem catalisar a oxidação reversível de H2 acoplado à regeneração de NADPH ou redução de polissulfeto quando disponível [30, 31]. Aqui, uma árvore de genes revisada que mostra amplamente o CPR revela a presença de dois subclados, que denominamos hyd1 e Hyd2, formando um clado maior de hidrogenase do Grupo 3b de organismos CPR (Fig. 4a). Ambos os grupos estão relacionados, mas são distintos das versões do Grupo 3b em outras bactérias e arquéias, particularmente Hyd2, que é separado de seus clados irmãos por um ramo relativamente longo (Fig. 4a).

Enzimas hidrogenase NiFe codificadas por bactérias CPR. uma Inserção da árvore de hidrogenase de subunidade grande não enraizada mostrando hidrogenases putativas do Grupo 3b em todo o CPR, juntamente com a presença / ausência de ocorrências de HMM correspondentes a outras subunidades. b Contexto genômico para agrupamentos de genes de hidrogenase, onde a posição 0 corresponde à localização da ORF que codifica a grande subunidade da hidrogenase NiFe. Apenas famílias de proteínas na mesma fita da subunidade grande são representadas nos gráficos, enquanto os diagramas de genoma abaixo dos gráficos incluem todas as famílias proximais, independentemente da orientação da fita. c Inserção de uma árvore de subunidade grande dentro das hidrogenases do Grupo 4. Ehr, complexos de conversão de energia relacionados à hidrogenase. Barras de escala representam o número médio de substituições por site

As hidrogenases NiFe do Grupo 3b bioquimicamente caracterizadas são conhecidas por serem enzimas tetraméricas [32]. Para examinar se as associações de subunidades eram consistentes entre as classes de hidrogenase, investigamos o contexto genômico das grandes subunidades de bactérias CPR usando uma abordagem de agrupamento de proteínas HMM emparelhada (a seção "Materiais e métodos"). Curiosamente, embora ambos os tipos de enzimas estivessem geralmente associados à pequena subunidade hidrogenase (fam019), além da subunidade catalítica, apenas hyd1 co-localizados com genes que codificam famílias de proteínas semelhantes às duas outras subunidades envolvidas na ligação NAD (P) + (gama, fam034) e transferência de elétrons (beta, fam012) (Fig. 4a). Pesquisas de HMM revelaram que essas subunidades também têm homologia com a sulfeto redutase anaeróbica A e B, sugerindo que todo o complexo pode estar envolvido no metabolismo do enxofre por meio da redução de compostos de enxofre reduzidos como polissulfeto [32, 33]. No entanto, em alguns casos, as subunidades gama e beta não estavam imediatamente a montante do gene que codifica a subunidade pequena (Fig. 4b) e, em outros, não foram detectadas de todo (Fig. 4a). Esta inconsistência pode ser devido à incompletude do genoma ou perdas específicas da linhagem dentro do hyd1 clado.

Embora os genomas com Hyd2 também codificou a proteína de subunidade pequena (fam019), as sequências foram consistentemente truncadas (média de 164 aminoácidos) em relação àquelas associadas com hyd1 e bactérias não RCP (média de 250 aminoácidos) (Arquivo adicional 2, Fig. S6a) [34]. Ambas as formas também compartilhavam fam002 em seu contexto genômico, alguns membros dos quais exibiam homologia com a chaperona associada à hidrogenase hipC. Fora dessas famílias, o contexto genômico imediato diferia para Hyd2: enquanto uma busca HMM recuperou sequências com o motivo de ligação NAD (subunidade gama) na vizinhança de alguns Hyd2, o agrupamento de proteínas mostrou que essas proteínas não eram nem proximais nem na mesma fita que a subunidade catalítica (Fig. 4ab). No entanto, alguns membros da fam013 que estavam no contexto genômico de Hyd2 aparentemente possuía um domínio de ligação NAD (P) situado dentro de um domínio de ligação FAD maior (PF07992). Da mesma forma, embora as pesquisas de HMM não tenham recuperado evidências de uma suposta subunidade beta perto Hyd2, encontramos uma família de proteínas (fam390) próxima a um subconjunto de Hyd2 que continha um dos dois domínios de ligação ferro-enxofre. Esses domínios eram distintos daqueles associados à suposta subunidade beta perto hyd1. Em última análise, não está claro se Hyd2 possui consistentemente (ou não tem) as subunidades gama e beta e, portanto, sua função permanece incerta.

Curiosamente, ambos hyd1 e Hyd2 foram dispersos em muitas linhagens do CPR, e algumas linhagens continham ambos os subtipos em genomas intimamente relacionados, mas distintos (Fig. 4a). Por exemplo, os genomas de Roizmanbacteria, que continham o maior número total de hidrogenases NiFe relacionadas ao Grupo 3b (n = 15), contido individualmente ou hyd1 ou Hyd2 sequências. O mapeamento da taxonomia do genoma na árvore de hidrogenase relacionada a 3b confirmou as incongruências com a árvore de espécies de CPR (Fig. 4a). Um padrão semelhante foi observado para sequências de bactérias CPR que caíram dentro de um subclade de referências do Grupo 4 que representam complexos de conversão de energia relacionados à hidrogenase (Ehr). Notavelmente, as sequências de bactérias CPR eram monofiléticas e agrupadas separadamente de outras proteínas Ehr, embora também não tivessem os resíduos de cisteína que se ligam aos cofatores de metal em outras enzimas do Grupo 4 (arquivo adicional 2, Fig. S6b). Esta observação sugere que as proteínas Ehr de organismos CPR provavelmente não podem interagir com H2.


Resumo

Sinopse

Os antibióticos são a base da saúde moderna. A descoberta do século 20 de sulfonamidas e antibióticos β-lactâmicos alterou imensamente a sociedade humana. As infecções bacterianas simples não eram mais a principal causa de morbidade e mortalidade, e a profilaxia com antibióticos reduziu muito o risco de infecção da cirurgia. O sistema de saúde atual requer antibióticos eficazes para funcionar. No entanto, as infecções resistentes a antibióticos estão se tornando cada vez mais prevalentes, ameaçando o surgimento de uma era pós-antibiótica. Para prevenir esta crise de saúde pública, são necessários antibióticos com novos modos de ação. Os antibióticos disponíveis atualmente têm como alvo apenas alguns processos celulares para exercer sua atividade: DNA, RNA, proteínas e biossíntese da parede celular. O metabolismo central bacteriano é subexplorado, oferecendo uma grande variedade de novos alvos potenciais que podem ser perseguidos para expandir o arsenal contra infecções microbianas.

Descoberta em 1997 como a primeira enzima na via do fosfato de metileritritol (MEP), a 1-desoxi-d -xilulose 5-fosfato (DXP) sintase é uma enzima dependente de difosfato de tiamina (ThDP) que catalisa a condensação descarboxilativa de piruvato e d - gliceraldeído 3-fosfato (d-GAP) para formar DXP. Este metabólito de cinco carbonos alimenta três vias essenciais separadas para o metabolismo bacteriano central: síntese de ThDP, síntese de fosfato de piridoxal (PLP) e a via de MEP para síntese de isoprenóides. Embora tenha sido identificado como um alvo para o desenvolvimento de agentes antimicrobianos, um progresso limitado foi feito em direção ao desenvolvimento de inibidores seletivos da enzima.

Esta conta destaca os avanços de nosso laboratório na última década para compreender esta enzima importante e única. Ao contrário de todas as outras enzimas dependentes de ThDP conhecidas, DXP ​​sintase usa um mecanismo sequencial aleatório que requer a formação de um complexo ternário antes da descarboxilação do intermediário lactil-ThDP. Seu grande sítio ativo acomoda uma variedade de substratos aceitadores, prestando-se a uma série de atividades alternativas, como a produção de α-hidroxicetonas, hidroxamatos, amidas, acetolactato e peracetato. O conhecimento obtido a partir de estudos mecanísticos e de especificidade de substrato guiou o desenvolvimento de inibidores seletivos com atividade antibacteriana e fornece uma base bioquímica para a compreensão da função da sintase DXP em células bacterianas.Embora seja um alvo de droga promissor, a centralidade da DXP sintase no metabolismo bacteriano confere desafios específicos para avaliar a atividade antibacteriana dos inibidores da DXP sintase, e a suscetibilidade da maioria das bactérias aos atuais inibidores da DXP sintase é notavelmente dependente do meio de cultura. Apesar desses desafios, o estudo da DXP sintase está prestes a revelar o papel da DXP sintase na adaptabilidade metabólica bacteriana durante a infecção, fornecendo uma imagem mais completa de como a inibição dessa enzima crucial pode ser usada para desenvolver novos antibióticos.


5: Metabolismo Bacteriano - Biologia

CAPÍTULO 5
FERMENTAÇÕES BACTERIANAS

As bactérias são um grande grupo de organismos unicelulares ou multicelulares sem clorofila, com um núcleo simples, multiplicando-se rapidamente por fissão simples, algumas espécies desenvolvendo uma fase de repouso (esporo) altamente resistente, algumas espécies se reproduzem sexualmente e algumas são móveis. Na forma, eles são esféricos, em forma de bastão, espirais ou filamentosos. Eles ocorrem no ar, água, solo, matéria orgânica em decomposição, animais e plantas. As formas saprofíticas são mais numerosas do que os parasitas. Algumas formas são autotróficas ”(Walker, 1988).

Existem várias famílias de bactérias presentes nos alimentos, a maioria das quais está relacionada com a deterioração dos alimentos. O importante papel das bactérias na fermentação dos alimentos é freqüentemente esquecido.

As bactérias do ácido láctico são um grupo de bactérias Gram positivas, sem respiração, não formadoras de esporos, cocos ou bastonetes, que produzem ácido láctico como o principal produto final da fermentação de carboidratos. São as bactérias mais importantes nas desejáveis ​​fermentações alimentares, sendo responsáveis ​​pela fermentação de pão de massa azeda, cerveja de sorgo, todos os leites fermentados, mandioca (para produzir gari e fufu) e a maioria dos vegetais & quotidescolhidos & quot (fermentados). Historicamente, bactérias do gênero Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus e Estreptococo são as principais espécies envolvidas. Vários outros foram identificados, mas desempenham um papel menor nas fermentações lácticas. As bactérias do ácido láctico foram revisadas recentemente por Axelsson (1998).

As bactérias do ácido láctico realizam suas reações - a conversão de carboidratos em ácido láctico mais dióxido de carbono e outros ácidos orgânicos - sem a necessidade de oxigênio. Eles são descritos como microaerofílicos, pois não utilizam oxigênio. Por isso, as mudanças que efetuam não provocam mudanças drásticas na composição dos alimentos. Alguns da família são homofermentativos, ou seja, produzem apenas ácido lático, enquanto outros são heterofermentativos e produzem ácido lático mais outros compostos voláteis e pequenas quantidades de álcool. Lactobacillus acidophilus, L. bulgaricus, L. plantarum, L. caret, L. pentoaceticus, L brevis e L. thermophilus são exemplos de bactérias produtoras de ácido láctico envolvidas em fermentações de alimentos. Todas as espécies de bactérias do ácido láctico têm suas próprias reações e nichos particulares, mas no geral, L. plantarum & # 150 um homofermentador - produz alta acidez em todas as fermentações vegetais e desempenha o papel principal. Todos os produtores de ácido láctico são bastonetes Gram-positivos não móveis que precisam de substratos de carboidratos complexos como fonte de energia. O ácido láctico que eles produzem é eficaz na inibição do crescimento de outras bactérias que podem decompor ou estragar os alimentos. Como todo o grupo é referido como & # 145bactérias do ácido láctico & # 146, pode parecer que as reações que eles realizam são muito simples, com a produção de um substrato. Isso está longe de ser verdade. As bactérias lácticas são um grupo diversificado de organismos com uma capacidade metabólica diversa. Essa diversidade os torna muito adaptáveis ​​a uma variedade de condições e é amplamente responsável por seu sucesso em fermentações de alimentos ácidos.

Apesar de sua complexidade, toda a base da fermentação do ácido láctico centra-se na capacidade das bactérias lácticas de produzir ácido, que então inibe o crescimento de outros organismos indesejáveis. Todos os produtores de ácido láctico são microaerofílicos, ou seja, requerem pequenas quantidades de oxigênio para funcionar. Espécies do gênero Estreptococo e Leuconostoc produzir o mínimo de ácido. Em seguida estão as espécies heterofermentativas de Lactobacillus que produzem quantidades intermediárias de ácido, seguido pelo Pediococcus e por último os homofermenters do Lactobacillusespécies que produzem mais ácido. Os homofermentadores convertem açúcares principalmente em ácido lático, enquanto os heterofermentadores produzem cerca de 50% de ácido lático mais 25% de ácido acético e álcool etílico e 25% de dióxido de carbono. Esses outros compostos são importantes porque conferem sabores e aromas particulares ao produto final. Os lactobacilos heterofermentativos produzem manitol e algumas espécies também produzem dextrana.

Leuconostoc mesenteroides é uma bactéria associada às fermentações de chucrute e picles. Este organismo inicia a fermentação de ácido láctico desejável nesses produtos. Ele difere de outras espécies de ácido láctico porque pode tolerar concentrações razoavelmente altas de sal e açúcar (até 50% de açúcar). L. mesenteroides inicia o crescimento em vegetais mais rapidamente em uma faixa de temperaturas e concentrações de sal do que qualquer outra bactéria láctica. Produz dióxido de carbono e ácidos que baixam rapidamente o pH e inibem o desenvolvimento de microrganismos indesejáveis. O dióxido de carbono produzido substitui o oxigênio, tornando o ambiente anaeróbio e adequado para o crescimento de espécies subsequentes de lactobacilos. A remoção do oxigênio também ajuda a preservar a cor dos vegetais e estabiliza qualquer ácido ascórbico presente.

Organismos do Gram positivo Propionibacteriaceae família são responsáveis ​​pelo sabor e textura de alguns alimentos fermentados, principalmente o queijo suíço, onde são responsáveis ​​pela formação de 'olhos' ou buracos no queijo. Essas bactérias decompõem o ácido láctico em ácidos acético e propiônico e dióxido de carbono.

Várias outras bactérias, para exemplo Leuconostoc citrovorum L. Dextranicum, Streptococcus lactis, S. Cremis, & amp licor e Brevibacterium espécies são importantes na fermentação de produtos lácteos. Eles não são discutidos em detalhes neste manuscrito.

5.2.1 Fermentação de ácido láctico

As bactérias lácticas pertencem a dois grupos principais - os homofermentadores e os heterofermentadores. As vias de produção de ácido láctico diferem para os dois. Os homofermentadores produzem principalmente ácido láctico, através da via glicolítica (Embden & # 150Meyerhof)). Os heterofermentadores produzem ácido láctico mais quantidades apreciáveis ​​de etanol, acetato e dióxido de carbono, através da via 6-fosfoglucanato / fosfocetolase. A via glicolítica é usada por todas as bactérias lácticas, exceto leuconostocs, lactobacilos do grupo III, enococos e weissellas. As condições normais necessárias para esta via são excesso de açúcar e oxigênio limitado. Axelsson (1998) fornece um relato aprofundado das vias bioquímicas para homo e heterofermentadores.


Métodos

Modelo metabólico

Nós convertemos o GEM de L. plantarum [28] para uma matriz estequiométrica, S. As reações reversíveis foram substituídas por reações irreversíveis para frente e para trás. Em seguida, adicionamos quatro vias metabólicas que são cruciais na fermentação de carboidratos no cólon, mas não estão presentes na rede: fermentação de propionato, fermentação de butirato, a via do acrilato e a via Wood-Ljungdahl. Usamos o banco de dados Kegg (http://www.genome.jp/kegg) [64] para adicionar as reações necessárias. Para o caminho Wood-Ljungdahl, seguimos o artigo de revisão [49]. O arquivo adicional 6 lista todas as reações e metabólitos do GEM, em particular aqueles que adicionamos ao GEM de L. plantarum.

Para calcular os fluxos através da rede metabólica em função do ambiente extracelular, usamos a análise de equilíbrio de fluxo com crowding molecular (FBAwMC) [34, 35]. FBAwMC assume que todas as reações através de um estão em estado estacionário:

onde ( vec ) é um vetor de todos os metabólitos, ( vec ) é um vetor que descreve o fluxo metabólico através de cada reação na rede, e S é a matriz estequiométrica. FBAwMC tenta encontrar uma solução ( vec ) da Eq. 8 que otimiza para uma função objetivo sob um conjunto de restrições ( vec _ < text > leq vec leq vec _ < text > ), com ( vec _ < text > ) e ( vec _ < text > ) os limites inferior e superior dos fluxos. Além disso, FBAwMC restringe a quantidade de enzimas metabólicas na célula. Isso leva à seguinte restrição

onde um_ equiv frac <>><>> ) é o "coeficiente de aglomeração", M a massa celular, V o volume da célula, v eu o volume molar da reação de catalisação da enzima eu e b eu é um parâmetro que descreve a proporcionalidade entre a concentração da enzima e o fluxo. Para uma derivação da Eq. 9 ver Ref. [34]. V prot é uma constante (0≤V prot≤1) representando a fração de volume de macromoléculas dedicadas a enzimas metabólicas. Usamos um valor de V prot= 0,2, igual ao valor usado em [36] para outras bactérias.

Os coeficientes de aglomeração não são conhecidos para todas as reações na rede metabólica. Portanto, seguindo Vazquez e colegas de trabalho [35], os coeficientes de aglomeração foram escolhidos aleatoriamente a partir de uma distribuição de coeficientes de aglomeração conhecidos para E. coli com base em volumes molares publicados (Metacyc [65]) e números de turnover (Brenda [46]). Tanto nas simulações bem misturadas quanto nas simulações espacialmente explícitas, permitimos influxo ilimitado de gás hidrogênio, água, sódio, amônio, fosfato, sulfato e prótons. Para calcular a taxa de crescimento, encontramos uma solução da Eq. 8 que maximiza a taxa de produção de ATP, dada a restrição de aglomeração (Eq. 9). A produção de ATP mostrou ser um bom substituto para a produção de biomassa [66] e nos permite evitar a complexidade adicional de, por exemplo, metabolismo de aminoácidos e metabolismo de vitaminas. A taxa de crescimento µ foi então calculado dividindo a taxa de produção de ATP por um fator de 27,2, o fator que foi usado para ATP na equação de biomassa do original L. plantarum modelo [28].

Modelo bem misturado

Simulações do modelo bem misturado são realizadas em Matlab, usando o COBRA Toolbox [67]. Usamos uma abordagem semelhante à Ref. [23] para modelar uma população de células em um ambiente bem misturado. Iniciamos 1000 células com coeficientes de aglomeração para todas as suas reações definidas de acordo com a distribuição experimental de E. coli (veja a seção Modelo metabólico) Começamos com uma concentração total de biomassa (B) de 0,01 grama de peso seco / litro (gDW / l), dividido igualmente por todas as 1000 metabactérias (ou seja, ∀ eu ∈ [ 1,1000]:B eu(0) = 10 −5 gr DW / l). No tempo t = 0 iniciamos o ambiente com uma concentração de glicose de 1,0 mM. Em cada etapa de tempo, a taxa de absorção máxima para cada metabólito j é uma função de sua concentração, c j(t), Como,

Em seguida, realizamos FBAwMC para todas as 1000 supra-bactérias e atualizamos as concentrações de todos os metabólitos que são excretados ou absorvidos, como,


Host & # x2013 Interação de patógenos: Metabolismo microbiano, patogenicidade e antiinfecciosos

Gottfried Unden estudou Biologia e Química na Ludwig Maximilians University Munich, onde recebeu seu Dr. rer. nat. Desde 1993, ele é Professor de Microbiologia no Departamento de Microbiologia e Pesquisa do Vinho da Universidade de Mainz. As principais áreas de trabalho são o metabolismo bacteriano e sua adaptação às mudanças nas condições ambientais, como a mudança do metabolismo aeróbio para o anaeróbio, ou o uso de ácido carboxílico como substrato para o crescimento e a função de sensores bacterianos.

Eckhard Thines estudou Biologia na Universidade de Kaiserslautern, Alemanha, onde recebeu seu PhD em Biotecnologia. Como pós-doutorado, ele passou dois anos no laboratório do professor Nicholas Talbot em Exeter, Reino Unido. Ele ingressou no Instituto de Biotecnologia e Pesquisa de Medicamentos (IBWF) em Kaiserslautern, Alemanha, em 2006. Desde 2009 é CSO do IBWF e desde 2012 é Professor de Biotecnologia e Pesquisa de Medicamentos na Universidade de Mainz. Sua pesquisa se concentra em pesquisa de fungicidas, modo de pesquisa de ação, identificação e validação de alvos, bem como metabolismo secundário de fungos. Além disso, ele está interessado em interações hospedeiro / patógeno em doenças fúngicas de plantas, e. Esca e podridão negra da uva.

Anja Schuffler estudou Biologia na Universidade de Kaiserslautern. Seu doutorado se concentrou na caracterização de produtos naturais fúngicos com atividade antimicrobiana. Em 2010, ela se juntou ao grupo do professor William Fenical no Scripps Institute for Oceanography em San Diego, onde estudou produtos naturais antibacterianos de estreptomicetos. Em 2011, ela iniciou uma bolsa de pesquisa no Instituto de Biotecnologia e Pesquisa de Medicamentos (IBWF, Kaiserslautern). Seu trabalho científico foca em produtos naturais bioativos de fungos e desenvolvimento de ensaios, a biossíntese de metabólitos secundários, bem como isolamento e taxonomia de fungos.

Paul M. Selzer estudou biologia, parasitologia e bioquímica na Universidade de Tubingen, Alemanha, onde também recebeu seu doutorado em bioquímica. Ele passou três anos no Molecular Design Institute e no Laboratório de Pesquisa de Parasitologia e Doenças Tropicais da Universidade da Califórnia, em San Francisco. Durante sua carreira, ele trabalhou como pesquisador e gerente científico para várias empresas farmacêuticas e atualmente é chefe de P&D de antiparasitários da Boehringer Ingelheim Animal Health, Alemanha. Ele também é professor visitante e professor do Instituto de Bioquímica da Universidade de Tubingen, e professor honorário do Departamento de Infecção, Imunidade e Inflamação da Universidade de Glasgow, Reino Unido.


Resultados e discussão

Diferenças estáveis ​​nas comunidades microbianas entre os locais do corpo ao longo do tempo

Quando as amostras de Costello et al. [6] e o estudo atual são comparados diretamente, as amostras agrupam por habitat corporal, mostrando excelente concordância entre os estudos (Figura 1a na [6] Figura 1b no estudo atual), apesar das diferenças na tecnologia de sequenciamento (454 e Illumina GA-IIx , respectivamente), comprimento médio de leitura (229 ± 16 (SD) nucleotídeos e 123 ± 17 (SD) nucleotídeos, respectivamente), e região do 16S sequenciado (V2 e V4, respectivamente). As distâncias UniFrac entre as 331 amostras de séries temporais que foram sequenciadas em Illumina e 454 foram significativamente correlacionadas, conforme determinado pela análise de Procrustes de matrizes de coordenadas principais UniFrac não ponderadas (M2 = 0,161 Monte Carlo P & lt 0,001 Arquivo adicional 1) e correlação de Pearson de distâncias UniFrac para pares de amostras (r = 0,91 P & lt 0,001). Conforme observado por Costello et al. [6], as comunidades bacterianas do intestino, da boca e da pele são composicionalmente distintas com base na análise de coordenadas principais de distâncias UniFrac não ponderadas entre as comunidades (UniFrac mede a similaridade da comunidade com base no grau em que compartilham o comprimento do ramo em uma árvore filogenética). A série temporal de longo prazo mostra pela primeira vez que esta diferenciação corpo-local é altamente estável por mais de um ano (Figura 1c), mas dinâmica dentro dos locais ao longo do tempo (Arquivos adicionais 2, 3, 4, 5, 6, 7 , 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15).

Análise de coordenadas principais de distâncias UniFrac não ponderadas entre as amostras. (uma) Costello et al. [6] amostras. (b) Amostras de séries temporais M3, F4. (c) M3, séries temporais F4, PC1 versus tempo (dias). Os painéis (a, b) e (c) mostram duas análises de coordenadas principais independentes. Para comparar o Costello et al. 454 dados (a) com os dados da série temporal Illumina (b), esses dados foram gerados em uma única análise de coordenadas principais de distâncias UniFrac em 500 sequências por amostra. O painel (c) não contém os dados 454, portanto, faz uso da profundidade de amostragem aumentada possível no Illumina (amostrado uniformemente para 5.000 sequências por amostra para cálculos UniFrac).

Arquivo adicional 2: mudança de rastreamento de animação na posição em PC1 e PC2 com o tempo para todos os locais do corpo em ambos os indivíduos. A visualização apresentada neste vídeo é diretamente comparável com a Figura 1a. As cores de fundo correspondem à Figura 1a. A série temporal M3 é mostrada como um traço vermelho (com a palma da mão esquerda em laranja), e a série temporal F4 é mostrada como um traço azul (com a palma da mão esquerda em branco). (MOV 1 MB)

Arquivo adicional 3: mudança de rastreamento de animação na posição em PC1 e PC2 com o tempo para todos os locais do corpo em M3. A visualização apresentada neste vídeo é diretamente comparável com a Figura 1a. As cores de fundo correspondem à Figura 1a. A série temporal M3 é mostrada como um traço vermelho (com a palma da mão esquerda em laranja). (MOV 631 KB)

Arquivo adicional 4: mudança de rastreamento de animação na posição em PC1 e PC2 com o tempo para todos os locais do corpo em F4. A visualização apresentada neste vídeo é diretamente comparável com a Figura 1a. As cores de fundo correspondem à Figura 1a. A série temporal F4 é mostrada como um traço azul (com a palma da mão esquerda em branco). (MOV 286 KB)

Arquivo adicional 5: mudança de rastreamento de animação na posição em PC1, PC2 e PC3 com o tempo para todos os locais do corpo em ambos os indivíduos. As cores de fundo correspondem à Figura 1a. A série temporal M3 é mostrada como um traço vermelho (com a palma da mão esquerda em laranja), e a série temporal F4 é mostrada como um traço azul (com a palma da mão esquerda em branco). (MOV 2 MB)

Arquivo adicional 6: mudança de rastreamento de animação na posição em PC1, PC2 e PC3 com o tempo para todos os locais do corpo em M3. As cores de fundo correspondem à Figura 1a. A série temporal M3 é mostrada como um traço vermelho (com a palma da mão esquerda em laranja). (MOV 2 MB)

Arquivo adicional 7: mudança de rastreamento de animação na posição em PC1, PC2 e PC3 com tempo para todos os locais do corpo em F4. As cores de fundo correspondem à Figura 1a. A série temporal F4 é mostrada como um traço azul (com a palma da mão esquerda em branco). (MOV 996 KB)

Evidência mínima de um microbioma de núcleo temporal entre ou dentro dos locais do corpo

Embora as diferenças gerais de composição entre os locais do corpo e os indivíduos fossem relativamente estáveis, nossos dados também sugerem uma "microbiota humana central" temporal surpreendentemente pequena dentro dos locais do corpo de um indivíduo (Figura 2) quando definimos o "centro" como os filotipos em nível de espécie em um dado habitat corporal que foi observado em todos os eventos de amostragem. Esses dados sugerem um microbioma central mínimo ao longo do tempo, onde o tamanho do núcleo diminui como: boca & gt intestino & gt palma direita ≈ palma esquerda & gt em todos os locais do corpo dentro de um indivíduo & gt em locais do corpo e indivíduos.

Microbioma central temporal. Fração de unidades taxonômicas operacionais em nível de espécie (OTUs) que compõem a microbiota do núcleo pelo número de amostras nas quais uma OTU deve estar presente para ser considerada parte do núcleo.

Nesta profundidade de sequenciamento, muitos mais OTUs são membros persistentes da comunidade, que aparecem em um determinado habitat corporal e permanecem por um longo período de tempo, mas não estão presentes de forma consistente o suficiente para serem considerados membros centrais, ou membros transitórios da comunidade, que aparecem em um habitat corporal e desaparece logo em seguida (Figura 3). Os táxons que compõem essas categorias persistentes e transitórias são significativamente diferentes (por exemplo, M3 gut: Gindep, 84.78 P = 1,80 × 10 -14). No intestino M3, as comunidades persistente e transitória são dominadas por Clostridia, Bacteroidia e, em menor extensão, Erysipelotrichi. A comunidade persistente, no entanto, também é composta por Betaproteobacteria e Deltaproteobacteria, enquanto a comunidade transitória é composta por Actinobacteria, Gammaproteobacteria, Epsilonproteobacteria e Verrucomicrobiae. Os resumos taxonômicos dos grupos persistentes e transitórios para todos os locais do corpo de ambos os indivíduos são apresentados no arquivo adicional 16.

Filiação à comunidade. Resumo de membros da comunidade para todas as OTUs em (uma) Intestino M3, (b) Intestino F4, (c) Língua M3, (d) Língua F4, (e) Palma esquerda M3, (f) Palma esquerda F4, (g) Palma direita M3, e (h) F4 palma direita. Os pontos são OTUs coloridos por sua abundância relativa mediana calculada em todas as amostras onde ocorrem, e os gráficos de pizza resumem os táxons de nível de classe observados como OTUs persistentes e transitórios.

Aplicamos várias técnicas para controlar a possibilidade de grupos persistentes serem confundidos com grupos transitórios se eles ocasionalmente caíssem abaixo do limite de detecção. Primeiro, ao calcular o número máximo de observações consecutivas para uma OTU, contamos uma única contagem zero para uma OTU como não interrompendo uma execução de observações consecutivas, desde que ambos os pontos de tempo adjacentes alcançassem contagens diferentes de zero para essa OTU. Em segundo lugar, sequenciamos 331 das amostras de séries temporais na plataforma 454 e recalculamos os resumos de taxa persistente e transiente. Descobrimos que, para ambos os indivíduos, a composição do intestino persistente e comunidades orais não foram significativamente diferentes entre 454 e Illumina, apesar de uma diferença de quase 40 vezes na profundidade de sequenciamento. No entanto, as comunidades de palmeiras persistentes foram significativamente diferentes em ambos os casos. Um possível fator de confusão nesta comparação é o viés do primer, uma vez que a região V2 foi sequenciada em 454. Portanto, realizamos 1.000 iterações jackknife desta análise por subamostragem dos dados Illumina para 5.000 sequências por amostra e recalculando a composição do grupo persistente para cada indivíduo e habitat do corpo. Nesta análise, sete dos oito pares individual / local do corpo nunca foram significativamente diferentes da composição persistente da comunidade no conjunto de dados Illumina completo. A única exceção foi a comunidade intestinal F4, que foi significativamente diferente em aproximadamente metade das iterações. Quando amostrada novamente a uma profundidade de 10.000 sequências por amostra, a comunidade intestinal F4 persistente nunca alcançou uma diferença significativa daquela determinada no conjunto de dados Illumina completo. Os resultados completos dessas análises são apresentados no arquivo adicional 17. A designação de grupos como 'persistentes' era, portanto, altamente reproduzível em plataformas de sequenciamento e amplicons, embora ainda seja possível que o erro de sequenciamento ou taxa de abundância muito baixa caiam ocasionalmente abaixo do limite de detecção pode resultar em tamanho subestimado do grupo persistente.

Comunidades microbianas temporariamente dinâmicas e correlações entre locais do corpo

As diferenças nas distâncias UniFrac nas palmas das mãos esquerda e direita em pontos de tempo adjacentes de ambos os indivíduos foram significativamente correlacionadas (correlação de Pearson para M3, r = 0,69, P = 2,07 × 10 -46 para F4, r = 0,64, P = 3,77 × 10 -16), possivelmente devido ao equilíbrio das comunidades microbianas entre as palmas por contato físico. Não vimos correlações entre outros locais do corpo. Enquanto a magnitude e a direção da mudança na dissimilaridade filogenética entre pontos de tempo adjacentes foram correlacionadas entre os locais de palmeiras, os taxa microbianos em nível de espécie presentes em cada mão não foram significativamente correlacionados, confirmando observações anteriores de que, em um único ponto de tempo, as mãos esquerda e direita de um único indivíduo pode compartilhar relativamente poucas OTUs [13].

Para locais com um único corpo, as distâncias dentro dos sujeitos foram menores do que as distâncias entre os sujeitos, sugerindo um padrão estável, consistente em todos os locais do corpo, nas diferenças entre os sujeitos ao longo do tempo. Por exemplo, as distâncias da amostra fecal entre sujeitos foram significativamente maiores do que as distâncias da amostra fecal M3 (t = 15,52 P & lt 0,001 unilateral, duas amostras t-teste) e dentro das distâncias da amostra fecal F4 (t = 33,45 P ≤ 0,001 unilateral, duas amostras t-teste).

A dinâmica da comunidade microbiana é especialmente aparente nas animações de análise de coordenadas principais (arquivos adicionais 2, 3, 4, 5, 6, 7) onde os tipos de amostra (sujeito, combinações de local do corpo) são representados como traços móveis contra um fundo do Costello et al. dados. Os rastros fornecem uma imagem imediata da variabilidade dentro de cada local do corpo, a distinção relativa dos locais e dos sujeitos e a velocidade relativa de mudança em cada local. Flores de certos taxa contribuem para as dissimilaridades dentro do local ao longo do tempo, como com o declínio e aumento da abundância relativa de Proteobacteria no intestino de M3 e F4 (arquivos adicionais 8 e 9, painel de filo (azul-petróleo)). Padrões semelhantes são aparentes em todos os níveis taxonômicos e locais do corpo (Arquivos adicionais 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15). Essas visualizações da dinâmica da comunidade microbiana irão adicionar outra dimensão aos estudos de longo prazo de estados clínicos variáveis, como doença inflamatória intestinal ou tratamentos com drogas e mudanças na dieta ou estilo de vida.


Compreendendo bactérias e enzimas

A natureza adaptável das bactérias torna possível explorar cepas específicas por suas qualidades benéficas. A biodegradação natural de resíduos orgânicos pode ser muito melhorada pela introdução de bactérias que ocorrem naturalmente, não geneticamente modificadas e não patogênicas. "Especialistas" em biodegradação são cientificamente selecionados por sua excepcional produção de enzimas e estabilidade a longo prazo.

No ambiente natural, as bactérias e as enzimas que elas produzem desempenham um papel significativo na biodegradação: as bactérias produzem as enzimas essenciais para metabolizar a fonte de alimento (resíduos orgânicos) em energia necessária para o crescimento do organismo vivo. As enzimas facilitam a fase do metabolismo em que os compostos complexos são quebrados em outros mais simples (catabolismo). Isso, por sua vez, acelera o processo de conversão da fonte de alimento em um suprimento de energia disponível para o crescimento e reprodução bacteriana (e produção contínua de enzima).

1. Antecedentes Gerais
Embora algumas bactérias possam causar certas doenças, muitas outras bactérias não são apenas inofensivas, mas na verdade são muito benéficas. A influência positiva desses numerosos organismos microscópicos úteis em nossa biosfera é incalculável. Por exemplo, sem bactérias, o solo não seria fértil (e todas as plantas e animais dependem, em última análise, da fertilidade do solo para materiais de sustentação da vida). Várias espécies de bactérias estão envolvidas na decomposição da matéria orgânica, fermentação e fixação do nitrogênio atmosférico. Muitas das bactérias comuns do ar, solo e água são capazes de digerir materiais orgânicos mortos, proteínas, carboidratos, gorduras e graxas, e celulose, quebrando-os em moléculas mais simples e na utilização dessas substâncias. Essa impressionante capacidade das bactérias como grupo de produzir uma grande diversidade de mudanças bioquímicas e resultados finais constitui um dos fatos notáveis ​​do mundo natural.

2. Taxa de multiplicação
Dadas as condições razoáveis ​​e adequadas para o crescimento, a taxa de multiplicação assexuada de bactérias é muito rápida, descobriu-se que uma célula se divide a cada 20 a 30 minutos. Assim, supondo que as condições conduzam a uma taxa de uma divisão a cada 30 minutos, uma única célula individual terá produzido 4 células no final da primeira hora, 16 no final de duas horas e cerca de um milhão (1.000.000) em ao final de quinze (15) horas. Assim, quando produtos contendo milhões de bactérias selecionadas por mililitro são introduzidos em condições adequadas, o eventual crescimento bacteriano é astronômico e, em virtude da presença de um grande número de bactérias eficientes e benéficas, a presença e o crescimento de bactérias menos produtivas e frequentemente bactérias nocivas de ocorrência natural são bastante reduzidas pela exclusão competitiva. Em termos simples, as bactérias selecionadas e introduzidas são mais eficientes e competem com as bactérias que ocorrem naturalmente pela fonte de alimento.

3. Condições que afetam o crescimento de bactérias

uma. Requisitos alimentares. As bactérias devem obter de seu ambiente todos os materiais nutrientes necessários para seus processos metabólicos e reprodução celular. O alimento deve estar em solução e deve passar para a célula.

b. Temperatura. Para cada bactéria, existem certos pontos cardeais de temperatura em que o crescimento é mais rápido. Embora as diferentes espécies de bactérias difiram amplamente, a temperatura ideal de crescimento para a maioria das bactérias está entre 5 C e 55 C (41 F a 131 F). O crescimento pode diminuir em temperaturas abaixo de 5 C (41 F) e danos às células podem ocorrer em temperaturas acima de 60 C (140 F). As células comuns (não esporos) são danificadas a temperaturas de 60 a 80 C (122 F a 140 F), portanto, uma única ebulição de um fluido ou mesmo pasteurização (aplicação de um calor de 63 C ou 145 F ) é suficiente para eliminá-los. Os esporos bacterianos, no entanto, devem ser submetidos a um aquecimento muito prolongado em altas temperaturas antes de serem afetados.

c. pH. Cada bactéria tem uma faixa de pH dentro da qual o crescimento é possível. O crescimento ocorrerá em ambientes com valores de pH entre 4,5 e 10, o valor de pH ideal difere muito entre as espécies, mas um ambiente mantido próximo ao neutro (pH 7) irá sustentar a maioria das espécies bacterianas.

d. Umidade. As bactérias requerem umidade. A importância da umidade para o crescimento bacteriano será vista claramente se for percebido que as bactérias não possuem partes bucais e todos os seus alimentos devem ser absorvidos de forma solúvel pelo processo de difusão através da parede celular sem umidade suficiente, portanto, o influxo de o alimento e o escoamento dos excrementos tornam-se impossíveis.

e. Oxigênio. Bactérias de vários tipos exibem grandes diferenças em sua relação com o oxigênio do ar. Alguns precisam de oxigênio para respirar e não podem crescer a menos que seja fornecido. São conhecidos como aeróbios. Outros crescem apenas na ausência de oxigênio livre e são incapazes de usá-lo em sua respiração, são chamados de anaeróbios. Outros ainda podem crescer em qualquer condição e são denominados facultativos.

1. Introdução
As bactérias apresentam grande diversidade em suas atividades fisiológicas. A energia necessária para realizar a atividade celular e os materiais de construção necessários para a formação de novas células durante a multiplicação são garantidos de várias maneiras. A aquisição de energia e materiais, por sua vez, está relacionada em grande medida às diferentes enzimas produzidas por várias bactérias.

2. Exemplos de ação enzimática
Muitas enzimas são liberadas das células que as produzem e, portanto, funcionam fora das células vivas ("extracelulares"). Por exemplo, as secreções do trato digestivo dos animais contêm muitas dessas enzimas extracelulares. Todas as enzimas do trato digestivo agem para converter as moléculas complexas dos alimentos em moléculas menores e mais simples, que são mais fáceis de transportar para a célula bacteriana. O processo de degradação é denominado hidrólise. Essa degradação, que envolve a conversão de sólidos em substâncias solúveis em água e de grandes moléculas solúveis em água em outras menores, é a essência do processo de digestão.

Algumas bactérias são capazes de formar esporos. Os esporos são formados geralmente quando as condições se tornam insatisfatórias para o metabolismo ativo e para a reprodução celular. Os esporos bacterianos são extremamente estáveis ​​e resistentes ao calor, secagem, luz, desinfetantes e outros agentes prejudiciais do que o organismo bacteriano vegetativo original. Os esporos podem sobreviver por muitos anos.

Quando condições mais adequadas se apresentam, o esporo germina e novamente desenvolve uma célula semelhante à que originalmente formou o esporo. Esta nova célula, sob condições favoráveis ​​de umidade, temperatura, pH e suprimento de alimentos, inicia o metabolismo ativo, a reprodução e a produção de enzimas.

As bactérias na natureza competem ativamente por nutrientes e as espécies mais bem-sucedidas em um determinado habitat serão aquelas capazes de utilizar melhor as condições que prevalecem. As bactérias solucionadoras de problemas introduzidas, especialmente selecionadas, benéficas, dominam o sistema ao qual são adicionadas e resolvem os problemas de forma segura e econômica, eliminando a fonte do problema (o lixo orgânico é decomposto, digerido e metabolizado).

Os odores são reduzidos pela eliminação de sua fonte e, como resultado, Demanda Bioquímica de Oxigênio (BOD), Demanda Química de Oxigênio (COD), Sólidos Suspensos (S / S) e Ácidos Graxos Voláteis (VFA) são reduzidos e os subprodutos primários deste microbiano degradação são água (H20) e dióxido de carbono (C02).

Bactérias aeróbicas:
Bactérias que requerem a presença de oxigênio para viver e funcionar.

Bactérias anaeróbicas:
As bactérias que não requerem a presença de oxigênio para sobreviver são capazes de viver e funcionar na ausência de oxigênio.

Bactérias:
Qualquer um de um grupo de microrganismos unicelulares microscópicos, onipresentes e diversos.

Demanda bioquímica de oxigênio I (BOD):
A quantidade de oxigênio necessária / consumida pelas bactérias durante a digestão dos resíduos orgânicos na água. A DBO é uma medida relativa da qualidade da água, pois quanto maior a DBO, maior a quantidade de resíduos orgânicos na água. Sobretaxas e multas são baseadas nos níveis de DBO das águas residuais.

Biodegradação:
A digestão de substâncias orgânicas por ação biológica, processo geralmente envolvendo micróbios, principalmente bactérias.

Demanda Química de Oxigênio (COD):
A quantidade de oxigênio necessária / consumida durante a digestão de resíduos orgânicos por meios químicos. COD é uma medida relativa da qualidade da água, pois quanto maior for o COD, maior será a quantidade de material orgânico na água.

Quimiotaxia:
A capacidade de um organismo, neste caso as bactérias, de detectar e se mover em direção a uma determinada substância química. Bactérias selecionadas exibem quimiotaxia positiva e se movem em direção a níveis mais elevados de fontes bioquímicas de alimentos. Essa capacidade é particularmente vantajosa quando o objetivo é a digestão eficiente de materiais orgânicos.

Unidade Formadora de Colônia I (CFU):
O método microbiológico padrão usado para contar bactérias. O número de células viáveis ​​que dão origem a uma colônia de bactérias em um meio de ágar adequado.

Enzima: (a / k / a catalisador químico não vivo):
Qualquer uma das várias substâncias orgânicas complexas originadas de microrganismos vivos e capaz de produzir certas mudanças químicas em substâncias orgânicas por ação catalítica. As enzimas são os catalisadores químicos das células vivas.

NOTA: Enquanto as bactérias metabolizam uma ampla variedade de material orgânico, as enzimas são específicas do substrato. Por exemplo:

A enzima protease cataboliza ("decompõe") a proteína
A enzima amilase decompõe amido e carboidratos
A enzima lipase decompõe a gordura e a gordura
A enzima xilanase decompõe o material vegetal (xilano)
A enzima celulase decompõe a celulose
A enzima urease decompõe a ureia

Bactérias facultativas:
Bactérias que são capazes de viver e funcionar na presença ou ausência de oxigênio.

Degradação microbiana:
As atividades benéficas selecionadas de bactérias na realização da biodegradação.

Motile:
Capaz de movimento. Bactérias selecionadas são móveis, permitindo-lhes mover-se em seu ambiente imediato.

Esporo:
A forma inativa / dormente, protegida / resistente que algumas bactérias podem assumir temporariamente, quando as condições não são satisfatórias para o metabolismo ativo e a reprodução celular.

Sólidos em suspensão (SS): Partículas de resíduos orgânicos em suspensão na água. Os níveis de SS são freqüentemente usados ​​para indicar a qualidade da água.

Ácidos graxos voláteis I (VFA):
Os ácidos graxos voláteis são os principais compostos responsáveis ​​pelos odores "azedos" ou "rançosos" que emanam do material orgânico em decomposição. A presença de altos níveis de AGV são indicativos de degradação microbiana ineficiente de resíduos orgânicos.


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