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Regulação da estrutura da cromatina

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Recentemente, revisei os diferentes níveis de estrutura da cromatina. O nível primário são os nucleossomos, onde o DNA está ligado às histonas e tem semelhança estrutural com "contas em um cordão". O nível secundário é uma fibra de 30 nm, e o nível terciário é formado por um loop radial das fibras.

Também tenho aprendido sobre o código das histonas e como as diferentes modificações nas histonas centrais se relacionam com a regulação da transcrição. Essas modificações são o mecanismo de regulação primário da estrutura da cromatina? Em outras palavras, a cromatina assume a estrutura mais compacta possível até que as modificações nas histonas sejam feitas para permitir a transcrição? Ou outros mecanismos regulatórios não relacionados à transcrição foram descobertos e caracterizados?


"Essas modificações são o mecanismo de regulação primário para a estrutura da cromatina?"

Depende de como você define primário, podemos atualmente pensar em modificações de histonas como primárias porque outros mecanismos reguladores ainda não foram bem estudados. Outra coisa em que você pode pensar são as várias proteínas regulatórias que interagem com as marcas das histonas para modificar a cromatina.

Não acho que você deva imaginar a cromatina assumindo "a estrutura mais compacta possível até que as modificações das histonas sejam feitas para permitir a transcrição", mas sim as modificações das histonas sendo um processo dinâmico com vários fatores de transcrição (uma classe de proteínas) entrando e adicionando / removendo marcas de histonas, bem como 'remodelação da cromatina' (adição / remoção de nucleossomos)

Como nota adicional, não acredito que se saiba muito sobre o estágio terciário que você mencionou inicialmente, então talvez isso possa desempenhar um grande papel nos mecanismos reguladores da estrutura da cromatina, mas não foi bem explorado.


Regulação da estrutura da cromatina e expressão gênica

O objetivo de longo prazo do meu laboratório é obter uma compreensão molecular dos processos epigenéticos que regulam a estrutura da cromatina e a expressão gênica. Para este fim, identificamos uma nova quinase em tandem em Drosophila, JIL-1, que se localiza especificamente nas regiões do interband genético ativo dos cromossomos larvais politênicos, fosforila a histona H3S10 e é enriquecido quase duas vezes na larva masculina transcricionalmente hiperativa cromossomo X politeno. Em JIL-1 hipomorfos, regiões ordenadas entre bandas de cromossomos politênicos são interrompidas e os braços cromossômicos altamente condensados. Variegação de efeito de posição (PEV) em Drosophila tem servido como um paradigma principal para a identificação e análise genética de determinantes conservados evolutivamente da regulação epigenética da estrutura da cromatina e silenciamento de genes e fornecemos evidências de que os alelos de perda de função da histona JIL-1 A quinase H3S10 pode atuar como supressores ou potencializadores de PEV, dependendo do ambiente de cromatina do locus repórter. Esses efeitos no PEV foram correlacionados com a disseminação dos principais marcadores heterocromatina dmH3K9 e HP1 para locais ectópicos nos braços do cromossomo com a suprarregulação mais pronunciada encontrada nos cromossomos X masculino e feminino. Com base nessas descobertas, propomos um modelo onde a atividade da quinase JIL-1 e a fosforilação da histona H3S10 na interfase funcionam para antagonizar a heterocromatização, regulando um equilíbrio dinâmico entre os fatores que promovem a repressão e a ativação da expressão gênica.

O silenciamento de genes é um processo crítico de desenvolvimento relevante para muitos problemas de saúde humana que incluem o câncer. Além disso, JIL-1 é o homólogo de Drosophila da quinase MSK1 de mamífero que também funciona como um regulador da estrutura da cromatina por fosforilação do resíduo de histona H3S10. No momento, os estudos em mamíferos têm sido direcionados para a análise da fosforilação da histona no contexto da transcrição gênica precoce imediata. No entanto, nossos resultados sugerem que o conceito de fosforilação de histonas deve ser expandido para ser considerado no contexto da regulação do silenciamento de genes. Assim, nossos estudos servirão para fornecer uma visão geral sobre os mecanismos moleculares de como a atividade da quinase modula a estrutura da cromatina e a regulação gênica que são diretamente relevantes para os humanos.


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Princípios da ligação metabólica à epigenética

Apesar dos desafios em compreender completamente os papéis dependentes do contexto do eixo metabólico & # x02013epigenética e a complexidade nas vias metabólicas e modificações da cromatina reguladas por eles, existem vários princípios universais subjacentes a esta conversa cruzada, que demonstram o surgimento evolutivo de mecanismos moleculares específicos que facilitam a dinâmica epigenômica sob alterações metabólicas.

A capacidade das modificações epigenéticas de responder às flutuações nas atividades metabólicas é uma consequência dos parâmetros termodinâmicos e cinéticos intrínsecos das enzimas modificadoras da cromatina (Quadro 1). A adição e remoção da maioria dessas modificações são catalisadas por enzimas (ou seja, & # x02018writers & # x02019 e & # x02018erasers & # x02019) que utilizam metabólitos como substratos ou cofatores (ou seja, metabólitos modificadores da cromatina (Figura 1)). Enzimas modificadoras da cromatina que usam substratos de metabólitos cujas concentrações fisiológicas são próximas ou mais baixas do que as enzimas & # x02019 K intrínsecam e Kd valores [G] são mais suscetíveis a alterações nas vias metabólicas do que aqueles cujos substratos estão presentes em excesso 13. Essa propriedade, portanto, permite que as flutuações metabólicas influenciem as atividades de certas enzimas modificadoras da cromatina e modulem os níveis de modificações epigenéticas específicas, e a diferença nas disponibilidades de substrato e valores de Km podem determinar sensibilidades relativas de modificações epigenéticas a alterações metabólicas 24,25 (Quadro 1 ) Por outro lado, as modificações da cromatina também podem ser adicionadas não enzimaticamente, das quais as propriedades cinéticas e termodinâmicas detalhadas são menos bem caracterizadas, mas são influenciadas até certo ponto pela lei de ação da massa.

A abundância de metabólitos modificadores da cromatina é regulada intracelularmente por vários mecanismos. Os metabólitos captados pelas células podem se difundir passiva ou ativamente através do plasma e da membrana nuclear para modificar a cromatina. Alternativamente, os metabólitos podem ser processados ​​internamente pela atividade de enzimas metabólicas que os convertem em substratos ou co-fatores para enzimas de remodelação da cromatina. Essas enzimas também podem se translocar para o núcleo, onde podem produzir localmente substratos para a modificação da cromatina. A conseqüência resultante da abundância de metabólitos na taxa de modificação da cromatina depende dos parâmetros cinéticos e termodinâmicos da enzima. Enzimas com razões [S] / Km iniciais na parte linear destacada da curva exibida são mais suscetíveis a perturbações às concentrações de substrato & # x02014, incluindo metiltransferases e acetiltransferases, entre outras. Finalmente, uma vez que as modificações tenham sido depositadas, as proteínas efetoras podem reconhecê-las e ligá-las usando módulos de ligação de proteínas específicos, sobre os quais determinam uma variedade de destinos intracelulares, incluindo a regulação da homeostase, desenvolvimento, regulação imunológica e tumorigênese.

Caixa 1:

Propriedades cinéticas e termodinâmicas de enzimas modificadoras da cromatina

As taxas de reações enzimáticas dependem de muitos fatores, incluindo parâmetros enzimáticos intrínsecos, como número de turnover e constante de Michaelis & # x02013Menten (Km) valores, abundância de enzimas, substratos, cofatores e ativadores ou inibidores alostéricos e outros fatores ambientais, como pH, temperatura e viscosidade local. Essas variáveis ​​juntas determinam a taxa geral de reação por meio de uma relação quantitativa que depende do mecanismo molecular da reação enzimática 236. Estudos que descrevem a bioquímica e a biologia estrutural das enzimas modificadoras da cromatina forneceram informações cruciais sobre seus reguladores e mecanismos catalíticos. Os mecanismos cinéticos das enzimas envolvidas na metilação do DNA, acetilação das histonas e metilação das histonas têm sido extensivamente investigados, particularmente quando se trata de questões relacionadas ao desenvolvimento de drogas, mostrando que o mecanismo catalítico exato para cada enzima modificadora da cromatina é diverso e amplamente dependente do contexto (veja a figura ) Por exemplo, as histona acetiltransferases PCAF e GCN5 exibem um mecanismo catalítico ternário ordenado no qual acetil-CoA se liga à enzima antes do peptídeo histona, que é seguido pela liberação de histona acetilada e, finalmente, a molécula CoA 237 & # x02013239. Em contraste, o p300 e o HAT8 funcionam por meio de um mecanismo de pingue-pongue que começa com a ligação da acetil-CoA e termina com a liberação da histona acetilada 240,241. Finalmente, cinética ternária aleatória foi observada na histona acetiltransferase de levedura Rtt109 242.

Dada a diversidade nos mecanismos catalíticos das enzimas modificadoras da cromatina e a variabilidade nos parâmetros cinéticos enzimáticos específicos, é provável que as modificações epigenéticas exibam especificidade devido a esses diferentes mecanismos. As propriedades termodinâmicas e cinéticas das modificações epigenéticas dependem do tipo de modificação, da enzima modificadora da cromatina correspondente, do locus genômico específico e da abundância de reguladores e cofatores alostéricos. Essa variabilidade resulta em dinâmicas distintas de deposição e renovação em resposta a perturbações do metabolismo. Direcionar diretamente para essas modificações epigenéticas mostrou que a dinâmica da acetilação das histonas é em geral mais rápida do que as mudanças no DNA e metilação das histonas 243, e que a acetilação e desacetilação ocorrem na escala de tempo de minutos na Vivo 244.245. A metilação da histona e do DNA, por outro lado, é mais estável em comparação com a acetilação, que pode constituir um tipo de memória epigenética em resposta a perturbações mais fortes, mas transitórias 243. Uma camada adicional de complexidade surge da afinidade heterogênea e da atividade dos modificadores da cromatina para diferentes modificações da cromatina 246 e diferentes loci genômicos 247,248. Variação na abundância de metabólitos modificadores da cromatina e K aparentem valores em diferentes células e tecidos podem, portanto, levar à heterogeneidade na sensibilidade das marcas epigenéticas às alterações metabólicas em diferentes contextos.

Existem vários mecanismos adicionais que permitem a regulação eficiente e precisa das modificações da cromatina catalisadas por enzimas pela atividade metabólica. Enzimas metabólicas envolvidas na síntese de metabólitos modificadores da cromatina, como acetil-CoA e S-adenosilmetionina (SAM), pode ser capaz de se localizar no núcleo e interagir com nucleossomos e enzimas modificadoras da cromatina para produzir metabólitos de forma eficiente em loci genômicos específicos 26 & # x0201332. Os níveis de metabólitos modificadores da cromatina, como SAM, são controlados por vários mecanismos, incluindo as entradas ambientais, como disponibilidade de nutrientes e coletores de grupo metil intracelular [G] que consomem SAM 33 & # x0201335. Os sumidouros do grupo metil são mediados por enzimas que metabolizam o SAM, permitindo que eles desviem os grupos metil para longe de enzimas como as histonas metiltransferases, afetando assim sua atividade. Esses mecanismos fornecem caminhos para o controle dos níveis de metabólitos e, portanto, para a cromatina detectar o estado metabólico intracelular.

As modificações epigenéticas influenciam os programas de transcrição por meio de vários mecanismos (Quadro 2). Todos esses resultados podem ser potencialmente influenciados pela regulação metabólica do epigenoma. Além disso, estudos recentes descobriram que os compartimentos da cromatina com atividade transcricional diferente podem segregar em organelas sem membrana por meio de separação de fase líquida & # x02013 [G] em resposta às modificações da cromatina, estabelecendo domínios de cromatina distintos com padrões distintos de regulação. A heterocromatina transcricionalmente inativa pode formar gotículas líquidas separadas por fase ao interagir com a proteína heterocromatina 1 (HP1) que reconhece e se liga à modificação da histona H3K9me, permitindo que a cromatina condense de forma estável dentro dessas gotículas 36 & # x0201338. Por outro lado, as regiões ativas da cromatina, como aquelas contendo acetilação de histonas, potencializadores [G] e super intensificadores [G] , também são capazes de se separar de fases por meio da interação com proteínas de ligação, como o bromodomínio [G] contendo proteínas 39 & # x0201341. Efeitos semelhantes que promovem a separação de fases também foram encontrados para serem mediados pela interação entre N 6-metiladenosina (m 6 A) em mRNA e as proteínas YTHDF de ligação a m 6 A 42. Embora seja uma questão em aberto se a separação de fases da cromatina é regulada pelo metabolismo, esses achados sugerem que a capacidade da cromatina de se separar nas células pode ser regulada por modificações epigenéticas derivadas de metabólitos e pode ser sensível ao metabolismo celular. Além disso, a separação de fases de outras biomoléculas tem mostrado concentrar moléculas em uma determinada fase para ativar processos de sinalização bioquímica 43. Se a separação de fases da cromatina também resulta na localização de metabólitos e ativação ou inibição de reações modificadoras da cromatina em uma fase específica permanece desconhecido, mas potencialmente serve como um mecanismo adicional para o controle preciso dos níveis de metabólitos locais e modificações da cromatina.

Caixa 2:

Influências das modificações epigenéticas na estrutura da cromatina e na expressão gênica

As primeiras pistas que sugerem as consequências funcionais de modificações epigenéticas particulares são o enriquecimento específico do locus e a associação com os níveis de expressão gênica e a regulação gênica. Embora não impliquem de forma conclusiva em causalidade, esses achados foram usados ​​para teorizar sobre a existência de um código de histona & # x02018 & # x02019, que postula que a presença e combinação de DNA específico e modificações de histona se ligam à regulação de programas de transcrição e eventos de expressão gênica 249 . Estudos nas últimas décadas revelaram duas maneiras principais de modificações epigenéticas para regular a expressão gênica: alterando a estrutura da cromatina local ou influenciando o recrutamento de efetores de proteínas não histonas para a cromatina 250. A cromatina pode ser aproximadamente classificada em duas categorias com base em suas propriedades estruturais e bioquímicas: heterocromatina condensada, transcricionalmente silenciada e eucromatina descondensada e ativamente transcrita. A formação de heterocromatina e eucromatina depende da existência de modificações epigenéticas. A acetilação da histona, tipicamente enriquecida em eucromatina, é capaz de neutralizar a carga positiva do resíduo de lisina modificado, interrompendo assim a interação entre histona e DNA e resultando em uma estrutura de cromatina aberta que facilita a transcrição ativa. A heterocromatina é tipicamente enriquecida de trimetilação de histona 3 lisina 9 (H3K9me3), que é ligada pela proteína heterocromatina 1 (HP1) que promove a compactação e disseminação de heterocromatina 251 e desencadeia a separação de fase líquida & # x02013 líquida pela formação de oligômeros 38.

As afinidades de ligação à cromatina de uma infinidade de proteínas, incluindo fatores de transcrição, remodeladores da cromatina e componentes da maquinaria de transcrição, podem ser moduladas por essas modificações. Isso é melhor demonstrado pela presença de módulos de ligação de cromatina & # x02018reader & # x02019 nessas proteínas, como os cromodomínios e dedos PHD que reconhecem e se ligam a histonas metiladas, e os bromodomínios e domínios YEATS que se ligam a histonas acetiladas 252,253. Foi hipotetizado que a associação entre H3K4me3 e a transcrição ativa é amplamente mediada pela ligação de H3K4me3 pelo dedo PHD da subunidade TAF3 de TFIID, um componente do complexo de pré-iniciação da RNA polimerase 254. Recentemente, foi demonstrado que a metilação do DNA reduz a afinidade de ligação da maioria dos fatores de transcrição, ao mesmo tempo que promove a ligação de proteínas contendo PHD por meio de interações hidrofóbicas com a citosina metilada 255. Leitores de algumas das modificações emergentes de histonas não canônicas, como succinilação 116 e crotonilação 256,257, também foram identificados recentemente 258.


Cromatina

Células germinativas na prófase da meiose I de um hermafrodita him-8. Os cromossomos X não sincronizados são enriquecidos em H3K9me2 (pontas de seta). H3K9ac é enriquecido em autossomos.

O silenciamento meiótico da cromatina não pareada é um fenômeno amplamente descrito em muitos organismos vertebrados e invertebrados. No C. elegans, como em outras espécies, os cromossomos desemparelhados acumulam um alto nível de modificações repressivas da cromatina que não são observadas nos cromossomos sinapses. Por exemplo, o cromossomo X masculino acumula um alto nível de dimetilação de histona H3 lisina 9 (H3K9me2), assim como o hermafrodita Xs que falham na sinapse devido à mutação (veja a figura). Esta modificação da histona amplamente conservada está associada à montagem da estrutura fechada da cromatina e à repressão transcricional. Nossos objetivos são compreender os mecanismos pelos quais a cromatina não pareada é reconhecida e silenciada durante a meiose e identificar os alvos cromossômicos do silenciamento meiótico.

Demonstramos que um ramo do C. elegansA pequena rede de RNA funciona na regulação da acumulação e distribuição meiótica de H3K9me2. Os componentes desta via incluem a RNA polimerase dirigida por RNA, EGO-1, e a proteína Argonaute / Slicer, CSR-1. MET-2 é a histona metiltransferase responsável pelo acúmulo de H3K9me2 na linhagem germinativa. Estamos trabalhando para entender como a atividade da pequena via de RNA de EGO-1 / CSR-1 influencia a atividade de MET-2 para direcioná-la em direção aos cromossomos não sincronizados.

Células germinativas na prófase da meiose I de machos mutantes do tipo selvagem e ego-1. H3K9me2 é enriquecido no cromossomo X em tipo selvagem (setas), mas não ego-1 masculino.

C. elegans fornece um sistema incomparável para estudar o mecanismo de silenciamento meiótico no contexto do desenvolvimento da linha germinativa. o C. elegans a linha germinal provou ser um excelente modelo para estudar a regulação genética e questões de desenvolvimento. Extensas ferramentas genéticas disponíveis em C. elegans nos permitem estudar a maquinaria de silenciamento meiótico, bem como abordar questões maiores sobre o papel do silenciamento meiótico no desenvolvimento e função da linha germinativa. Um foco de nosso trabalho atual é identificar fatores adicionais que atuam em conjunto com MET-2 e / ou a via EGO-1 / CSR-1 para regular o acúmulo de H3K9me2. Outro foco é identificar os locais onde as modificações do H3K9me2 são depositadas em cromossomos desemparelhados. Ao compreender o mecanismo e os alvos da acumulação do H3K9me2, estaremos em posição de investigar as implicações desse processo no desenvolvimento. Esperamos que nossos resultados facilitem o estudo do silenciamento meiótico em animais mais complexos, incluindo mamíferos.


PERSPECTIVAS E CONCLUSÃO

Nossas estruturas 3D crio-EM com resolução de 11 Å forneceram as características estruturais fundamentais da elusiva fibra de cromatina de 30 nm e uma base sólida para a compreensão do princípio básico da compactação da cromatina, enquanto as estruturas de alta resolução da fibra de cromatina são necessárias para descobrir muito mais detalhes estruturais para as interações nucleossomo-nucleossomo, nucleossomo-H1 e H1-H1 nas fibras da cromatina. Além disso, nossas estruturas crio-EM implicam claramente na presença de três interfaces de interação importantes na fibra de 30 nm, embora ainda não esteja claro como essas interfaces são reguladas por diferentes fatores de cromatina. Em relação à variação de NRLs in vivo, fibras de cromatina reconstituídas com uma combinação de diferentes NRLs também serão bons candidatos para estudos de molécula única e crio-EM no futuro. Esses estudos adicionais não irão apenas aumentar nossa compreensão da diversidade das estruturas da cromatina in vivo, mas também fornecer uma base estrutural para como diferentes combinações de sequências de DNA, NRLs, variantes de histonas, modificações da cromatina e proteínas arquitetônicas da cromatina podem ser coordenadas para regular com precisão o função do DNA genômico no núcleo.

Ainda é um quebra-cabeça se os resultados estruturais dos estudos in vitro podem representar a estrutura real das fibras da cromatina in situ. Portanto, a organização 3D das fibras da cromatina nos núcleos intactos precisa ser mais estudada usando técnicas recentemente desenvolvidas. Fibras de cromatina bem caracterizadas reconstituídas in vitro, incluindo fibras compactadas de 30 nm e arranjos nucleossômicos abertos, seriam referências estruturais perfeitas para analisar a organização 3D das fibras de cromatina in situ nesses estudos. A combinação de crio-EM com técnicas de imagem de fluorescência de super-resolução foi desenvolvida recentemente para visualizar e quantificar a ultraestrutura de células crio-preservadas (Chang et al. 2014 Liu et al. 2015). A combinação de abordagens genômicas (como micro-C e RICC-seq) e técnicas de imagem baseadas em CRISPR (agrupamento regularmente intercalado de repetição palindrômica curta) podem nos permitir sondar a ultraestrutura e a organização 3D da fibra de cromatina em regiões genômicas definidas no intacto núcleos. Sem dúvida, mais detalhes estruturais para a organização 3D das fibras da cromatina in situ podem ser obtidos pela aplicação dessas técnicas de imagem avançadas no futuro.


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Tópicos atuais em Biologia do Desenvolvimento. Vol. 56 2003. p. 55-83 (Current Topics in Developmental Biology Vol. 56).

Resultado da pesquisa: Capítulo no livro / Relatório / Procedimento da conferência ›Capítulo

T1 - Regulação da Estrutura da Cromatina e Atividade Genética por Polimerases Poli (ADP-Ribose)

A N2 - Poli (ADP-ribose) polimerase 1 (PARP1) é uma proteína nuclear abundante que desempenha um papel importante no reparo do DNA e na resposta à infecção. Aqui, revisamos as evidências recentes de que PARP1 e proteínas relacionadas também realizam funções cruciais regulando genes durante o desenvolvimento normal. Estudos genéticos em mamíferos e Drosophila implicaram que PARPs medeiam respostas rápidas a estímulos ambientais, incluindo infecção, estresse, hormônios e sinais de crescimento. Além disso, essas polimerases podem controlar processos fundamentais que moldam e remodelam a cromatina diferencialmente nos muitos tipos de células de um embrião em desenvolvimento. Discutimos um mecanismo unificado de ação de PARP durante o reparo do DNA, a transcrição do gene e a modulação da cromatina.

AB - Poly (ADP-ribose) polimerase 1 (PARP1) é uma proteína nuclear abundante que desempenha um papel importante no reparo do DNA e na resposta à infecção. Aqui, revisamos as evidências recentes de que PARP1 e proteínas relacionadas também realizam funções cruciais regulando genes durante o desenvolvimento normal. Estudos genéticos em mamíferos e Drosophila implicaram que PARPs medeiam respostas rápidas a estímulos ambientais, incluindo infecção, estresse, hormônios e sinais de crescimento. Além disso, essas polimerases podem controlar processos fundamentais que moldam e remodelam a cromatina diferencialmente nos muitos tipos de células de um embrião em desenvolvimento. Discutimos um mecanismo unificado de ação de PARP durante o reparo do DNA, a transcrição do gene e a modulação da cromatina.


Metilação de DNA dirigida por RNA

Steven E. Jacobsen é investigador do Howard Hughes Medical Institute e professor de célula molecular e biologia do desenvolvimento na Universidade da Califórnia, em Los Angeles, EUA. Sua pesquisa está focada em mecanismos de herança epigenética em plantas, incluindo a genética e genômica de metilação de DNA, metilação de histonas, bem como pequenas vias de silenciamento conduzidas por RNA. Com mais de 130 publicações relacionadas à epigenética, ele fez contribuições fundamentais para este campo emergente de pesquisa.

Jacobsen lecionou sobre a via de metilação de DNA dependente de RNA (RdDM) que Arabidopsis thaliana utiliza para manter e provavelmente estabelecer a metilação do DNA da citosina a fim de silenciar genes e transposons. Enquanto as metiltransferases de DNA bem estudadas MET1, CMT3 e DRM2 são responsáveis ​​por manter padrões de metilação pré-estabelecidos por meio de mecanismos clássicos, aparentemente DRM2 - um homólogo de mamífero Dnmt3 & # 8211 é o único a mediar RdDM. O recrutamento de DRM2 para o respectivo sítio de DNA é, portanto, mediado por uma interação complexa de Polimerase IV (PolIV), Polimerase V (PolV), as espécies de RNA produzidas por elas e vários outros fatores.

Uma vez que a ligação de PolIV e PolV ao DNA não mostra nenhuma especificidade de sequência significativa, as marcas epigenéticas são mais prováveis ​​de representar seus locais de reconhecimento. PolIV demonstrou interagir com SHH1, que se liga a H3K9me, uma marca de silenciamento frequentemente encontrada em sítios RdDM, enquanto a interação indireta de PolV com SUVH2 direciona-o para DNA metilado. Pela fusão de SUVH2 com um domínio de dedo de zinco direcionado a um epialelo não metilado do fator de transcrição homeodomínio FWA, o laboratório de Jacobsen demonstrou que SUVH2 é suficiente para recrutar PolV, estabelecer a metilação do DNA e, por fim, causar o silenciamento do gene.

Mecanicamente, PolV e PolV associados a sítios RdDM produzem siRNAs e lncRNAs de 24 nucleotídeos, respectivamente. Esses RNAs interagem com uma série de outros fatores como AGO4 para estabelecer uma rede muito complexa que, em última análise, resulta no recrutamento de DRM2 para preservar os padrões de metilação existentes. Curiosamente, existe uma estreita interdependência entre essas marcas de metilação e outras modificações epigenéticas, como por exemplo a metilação das histonas, que gera laços de reforço robustos. No entanto, ainda não está claro como ocorre o estabelecimento inicial da RdDM.


Resumo

Os fatores de transcrição pioneiros desempenham um papel fundamental no estabelecimento da competência para a expressão gênica e no início da programação e reprogramação celular, e sua desregulação causa efeitos graves na saúde humana, como a promoção da tumorigênese. Embora mais de 200 fatores de transcrição sejam expressos em cada tipo de célula, apenas um pequeno número de fatores de transcrição é necessário para provocar mudanças dramáticas no destino da célula no desenvolvimento embrionário e na conversão do destino da célula. Entre esses fatores-chave de transcrição, um subconjunto denominado “fatores de transcrição pioneiros” tem uma capacidade notável de direcionar o DNA nucleossômico, ou cromatina fechada, no início do desenvolvimento, geralmente levando à abertura local da cromatina, estabelecendo assim competência para a expressão gênica. Embora mais fatores de transcrição-chave tenham sido identificados como fatores de transcrição pioneiros, os mecanismos moleculares por trás de suas propriedades especiais estão apenas começando a ser revelados. Compreender os mecanismos pioneiros aumentará nossa capacidade de controlar com precisão o destino das células à vontade para fins de pesquisa e terapêuticos.

  • Mecanismos biológicos e destinos de células gt
  • Mecanismos biológicos e biologia regulatória
  • Biologia do desenvolvimento e linhagens gt

8.4: Genes e cromatina em eucariotos

  • Contribuição de Gerald Bergtrom
  • Professor Emérito (Biociências) na University of Wisconsin-Milwaukee

Os cromossomos e a cromatina são uma associação exclusivamente eucariótica de DNA com mais ou menos proteína. O DNA bacteriano (e o DNA procariótico em geral) é relativamente & lsquonaked & rsquo & ndash não visivelmente associado à proteína.

A micrografia eletrônica de um interfase a célula (abaixo) revela que a própria cromatina pode existir em vários estados de condensação.

A cromatina é condensada ao máximo durante a mitose, formando cromossomos. Durante a interfase, a cromatina existe em formas mais ou menos condensadas, chamadas Heterocromatinae eucromatinarespectivamente. A transição entre essas formas de cromatina envolve mudanças nas quantidades e tipos de proteínas ligadas à cromatina e pode ocorrer durante a regulação gênica, ou seja, quando os genes são ativados ou desativados. Os genes ativos tendem a estar na eucromatina mais dispersa, de modo que as enzimas de replicação e transcrição têm acesso mais fácil ao DNA. Os genes que são inativos na transcrição são heterocromáticos, obscurecidos por proteínas adicionais da cromatina presentes na heterocromatina. Estaremos examinando alguns experimentos que demonstram isso em um capítulo posterior.

Podemos definir três níveis de organização da cromatina em termos gerais:

1. DNA enrolado em torno da forma de proteínas histonas nucleossomos em uma estrutura & quotbeads em uma string & quot.

2. Múltiplos nucleossomos enrolam-se (condensam), formando estruturas de fibra de 30 nm (solenóide).

3. O empacotamento de ordem superior da fibra de 30 nm leva à formação de cromossomos metafásicos vistos na mitose e na meiose.

Os níveis de estrutura da cromatina foram determinados em parte por isolamento seletivo e extração da cromatina celular em interfase, seguido pela extração química seletiva dos componentes da cromatina. As etapas são:

Os núcleos & middot são primeiro isolados das células.

& middot O envelope nuclear se rompeu suavemente para não perturbar fisicamente a estrutura da cromatina.

No meio, a cromatina pode ser extraída suavemente por um dos vários tratamentos químicos diferentes (alto teor de sal, baixo teor de sal, ácido).

Os níveis de estrutura da cromatina são ilustrados abaixo.

A extração de sal dissocia a maioria das proteínas da cromatina. Quando um extrato com baixo teor de sal é centrifugado e o pellet ressuspenso, a cromatina restante parece contas em um cordão. Embrulhado em DNA nucleossomos são as contas, que por sua vez estão ligadas por comprimentos uniformes de DNA metafórico & ldquostring & rsquo ( # 1 na ilustração acima). Um extrato de cromatina com alto teor de sal aparece como uma bobina de nucleossomos, ou Fibra solenóide 30 nm (# 2 acima de). Outros protocolos de extração revelaram outros aspectos da estrutura da cromatina mostrada em #s 3 e 4 acima de. Os cromossomos vistos na metáfase da mitose são a & lsquoa ordem mais alta & rsquo, a forma mais condensada da cromatina.

O filamento de 10 nm do nucleossomo & lsquobeads-on-a-string & rsquo remanescente após uma extração com baixo teor de sal pode ser visto em um microscópio eletrônico, conforme mostrado abaixo.

Quando esses colares de nucleossomo foram digeridos com a enzima desoxirribonuclease (DNAse), o DNA entre as & lsquobeads & rsquo foi degradado, deixando para trás filamentos encurtados de 10 nm após um curto período de digestão, ou apenas contas únicas nas contas após uma digestão mais longa (abaixo).

Roger Kornberg (filho do Prêmio Nobel Arthur Kornberg que descobriu a primeira enzima de replicação da DNA polimerase) participou da descoberta e caracterização dos nucleossomos enquanto ainda era pós-doutorado! A eletroforese do DNA extraído dessas digests revelou nucleossomos separados por um trecho de DNA & ldquolinker & rdquo de cerca de 80 pares de bases. O DNA extraído dos nucleossomos tinha cerca de 147 pares de bases de comprimento. Este é o DNA que foi envolvido em torno das proteínas do nucleossomo.

Depois de separar todas as proteínas do DNA nucleossômico, cinco proteínas foram identificadas (ilustradas abaixo).

Histonas são proteínas básicas que contêm muitos lisina e arginina aminoácidos. Suas cadeias laterais carregadas positivamente permitem que esses aminoácidos se liguem ao ácido, com carga negativa espinha dorsal de fosfodiéster de DNA de dupla hélice. O DNA envolve um octâmero de histonas (2 de cada uma das 4 proteínas histonas) para formar o nucleossomo. Cerca de um grama de histonas está associado a cada grama de DNA. Após uma extração de cromatina com alto teor de sal, a estrutura visível no microscópio eletrônico é o solenóide de 30 nm, a bobina de nucleossomos modelados na figura abaixo.

Como mostrado acima, simplesmente aumentar a concentração de sal de uma preparação de nucleossomo já extraída fará com que o & lsquonecklace & rsquo se dobre na estrutura do solenóide de 30 nm.

As you might guess, an acidic extraction of chromatin should selectively remove the basic histone proteins, leaving behind an association of DNA with non-histone proteins. This proved to be the case. An electron micrograph of the chromatin remnant after an acid extraction of metaphase chromosomes is shown on the next page.

DNA freed of the regularly spaced histone-based nucleosomes, loops out, away from the long axis of the chromatin. Dark material along this axis is a protein scaffolding that makes up what&rsquos left after histone extraction. Much of this protein is topoisomerase, an enzyme that prevents DNA from breaking apart under the strain of replication.


Assista o vídeo: DNA, Cromatina e Cromossomo: Diferenças? Biologia Molecular - Bio Aulas (Agosto 2022).