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Vazamento do promotor T7

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Um gene pode ser expresso sob o promotor T7 em uma cepa de E. coli (por exemplo, DH5 alfa), que não possui o gene da polimerase T7 codificado em seu genoma? Em outras palavras, o promotor T7 está vazando?

Para ser mais específico, como é possível que uma cepa regular de E. coli, que não codifica para a polimerase T7, possa crescer em meio seletivo kan se for transformada com um plasmídeo que possui o gene kanR sob o promotor T7?


Aparentemente não, o vazamento pode ser controlado regulando rigidamente a polimerase T7 com um promotor rígido (neste caso lacUV5).


Sistemas de expressão pET e pBAD

Este sistema foi desenvolvido para uma variedade de aplicações de expressão, incluindo promotores híbridos, múltiplos locais de clonagem para a incorporação de diferentes parceiros de fusão e locais de clivagem por protease. O plasmídeo pET, mostrado na Figura 1, é uma construção de 5,4 kb com os seguintes elementos:

  • lacI codifica para a proteína repressora lac
  • códigos ampR para resistência à ampicilina
  • Origem de replicação ori col E1
  • códigos lacO para o operon lac
  • PT7 codifica para o promotor T7, que é específico apenas para T7 RNA polimerase
  • Códigos TT7 para o terminador T7
  • O sítio de clonagem múltipla MCS tem a sequência que codifica a proteína de interesse.

O uso de PT7, uma sequência de 20 nucleotídeos que o E não reconhece, é uma característica fundamental. Na sequência do genoma procariótico, coli RNA polimerase não ocorre, nem T7 RNA polimerase, portanto, PT7 não é ativado na ausência de T7 RNA polimerase e nenhuma proteína de interesse é produzida. Conforme descrito abaixo, quando o PT7 é ativado como um promotor viral, ele se transcreve rapidamente, a uma velocidade máxima de cerca de 230 nucleotídeos por segundo, cerca de cinco vezes mais rápido do que o RNA da polimerase de E. Coli. A expressão requer uma cepa hospedeira sob o controle do promotor lacUV5 indutível por IPTG lisogenizado por um fragmento de fago DE3, que codifica a polimerase de RNA de T7, e um esquema do processo é mostrado na Figura 2.

Figura 2

Há uma cópia do gene lacI encontrado no genoma de E. coli e pET. LacI é um gene fracamente expresso e um aumento de 10 vezes da repressão é alcançado quando o mutante do promotor de superexpressão LacIq é empregado.35 A proteína repressora de lac, LacI, reprime o promotor lacUV5 da célula hospedeira e o promotor híbrido T7 / lac codificado pelo plasmídeo de expressão. O tetrâmero lacI liga-se ao operador lac no genoma da célula hospedeira e no plasmídeo na ausência de um indutor. Isso evita que a célula hospedeira produza RNA polimerase T7 e evita que a proteína de interesse seja produzida pelo plasmídeo. Ele se liga e causa a liberação de lacI tetramérico do operador lac no genoma e no plasmídeo quando o indutor, tipicamente IPTG, é introduzido, o que desencadeia a expressão da polimerase de RNA T7 na célula hospedeira. Desta forma, a transcrição do gene alvo do promotor híbrido T7 / lac é iniciada.

Pode ocorrer baixa expressão de fundo de plasmídeos de expressão de pET, o que pode ser reduzido por co-expressão com o plasmídeo pLysS ou pLysE de lisozima de T7, um inibidor natural da polimerase de RNA de T7. No que diz respeito ao promotor responsivo à tetraciclina (Tc) cognato, estes plasmídeos abrigam o gene da lisozima T7 em orientações silenciosas (pLysS) e expressas (pLysE).
Embora o promotor lacUV5 seja menos sensível do que o promotor lac à regulação do complexo cAMP-CRP (proteína do receptor de cAMP), a incorporação de glicose a 1% no meio de cultura reduz os níveis de cAMP e melhora significativamente a repressão do promotor e # 8217s. O controle da expressão da proteína alvo é melhorado por cepas hospedeiras deficientes no gene lacY, que codifica a lactose permease.

O sistema de expressão pBAD

A regulação do operon arabinose em E. coli é dirigida pelo produto do gene arabinose38, que controla a taxa de síntese das proteínas AraE, AraF e AraG necessárias para a absorção de arabinose, bem como as enzimas AraB, AraA e AraD necessárias por seu catabolismo. Isso implica que o estado intrínseco dos promotores específicos de ara & # 8217 está desativado e o AraC os ativa, enquanto o estado de conjunto do promotor do operon lac & # 8217s está ativado e o repressor lac o desliga. Além disso, o pBAD é reprimido por catabólitos. Isso implica que o crescimento da cultura reprimirá ainda mais a expressão na presença de glicose. Embora a expressão de um gene de plasmídeo clonado contendo o promotor araBAD possa ser modulada em culturas cultivadas na presença de concentrações sub-saturadas de arabinose em várias ordens de magnitude, as células individuais são totalmente induzidas ou não induzidas.

As células com o gene de transporte de arabinose (araE) que é controlado nativamente são induzidas ou não induzidas, a fração relativa da qual é controlada pela concentração de arabinose. Em função da concentração do indutor, a variação da média populacional na expressão de pBAD é proporcional à porcentagem de células que são totalmente induzidas (versus não induzidas), em vez do nível de expressão em células individuais. Em E. coli, este fenômeno todo-ornona, que pode ter efeitos indesejáveis ​​na expressão de genes heterólogos, pode ser eliminado pela expressão de araE de promotores independentes de arabinose.

Todas as células na população têm aproximadamente o mesmo nível de indução nessas células modificadas com transporte de arabinose.40 Portanto, as cepas capazes de transportar L-arabinose, mas não metabolizá-la, como uma cepa de recA, endA, são as mais apropriadas.
Os plasmídeos de expressão baseados no promotor araBAD são projetados para um controle de expressão de fundo rígido e controle preciso dos níveis de expressão da proteína alvo & # 8217s. Isso contrasta com a indução de tudo ou nada que a maioria dos outros sistemas de expressão bacteriana alcançou. Um plasmídeo pBAD, derivado de pBR322 e mostrado na Figura 3, é uma construção de 4,1 kb que tem os seguintes elementos:

  • ORF araC que codifica a proteína araC
  • códigos ampR para resistência à ampicilina
  • Origem de replicação ori col E1
  • promotor pBAD araBAD
  • região de terminação da transcrição rrnB
  • O sítio de clonagem múltipla MCS tem a sequência que codifica a proteína de interesse.

No operon arabinose, o dímero AraC liga três locais, I1, I2 e O2. Na ausência de arabinose, 210 pares de bases a montante de pBAD, o dímero AraC contata o local O2 localizado dentro do gene araC. Como mostrado, a outra metade do dímero araC contata o local I1 na região do promotor que forma a alça de DNA. Portanto, a transcrição de pBAD e do promotor de araC (pC) é inibida pela alça. O dímero araC muda sua conformação após a ligação de arabinose de modo que se liga ao local pBAD I2 em vez do local O2. Isso remove a estrutura do loop e a transcrição pela RNA polimerase é iniciada. A proteína receptora de cAMP (CRP) estimula a ligação do dímero araC aos locais I1 e I2, o que significa que a repressão catabólica mediada por glicose pode reduzir a expressão de fundo de araBAD.


RNA polimerases

(a) Sistemas de expressão cromossômica.

Um gene de fago RNA Pol pode ser integrado de forma estável no E. coli cromossomo por meio de um lisogênio λ e expresso sob o controle indutível por IPTG do lacUV5 promotor. Uma expressão oportuna do gene T7 RNA Pol cromossômico conduziria então a expressão do gene estrangeiro ligado ao promotor T7 clonado em um vetor separado.

Quando as células eucarióticas são usadas como hospedeiros, uma expressão cromossômica semelhante do gene Pol do fago pode ser manipulada por transformação das células com o DNA apropriado. Alternativamente, a expressão da RNA polimerase no citoplasma pode ser direcionada ao núcleo para conduzir a expressão de um gene estranho localizado no cromossomo. Em tais sistemas de expressão cromossômica reversa, o gene do fago RNA Pol transportado em um vetor de plasmídeo (54) ou vetor de vírus vaccinia (55) é expresso em células eucarióticas (por exemplo, células L e NIH 3T3 de camundongo) do promotor de metalotioneína de camundongo ou promotor de vaccinia , respectivamente. O RNA Pol é então transportado para o núcleo da levedura ou células de mamíferos pelo sinal de localização nuclear ligado à polimerase (Pro – Lys – Lys – Lys – Arg – Lys – Val) do antígeno T grande SV40 (50, 54, 56) . O T7 RNA Pol não modificado é principalmente citoplasmático e é incapaz de direcionar um nível detectável de expressão do gene T7 ligado ao promotor no núcleo. Quando a polimerase é superexpressada a um nível de 0,5-1,5% da proteína total da célula, entretanto, algum T7 RNA Pol pode entrar no núcleo passivamente. A expressão de tais construtos T7 mostrou ser pelo menos seis vezes mais eficiente do que uma expressão análoga dirigida a partir do promotor RSV-LTR que é considerado um dos mais fortes conhecidos em células de mamífero.

Observe que várias linhas de células de mamíferos exibem um nível considerável de expressão do promotor T7, mesmo na ausência de T7 RNA Pol. Essa expressão de fundo, que na verdade interfere na transcrição realizada pelo T7 RNA Pol, deve-se à ligação de alguns fatores nucleares ao promotor T7, permitindo assim a transcrição pelo RNA Pol II. O uso de promotores T7 mutantes, por exemplo, com alterações simultâneas em −13 (A a T) e +1 (G a C), diminui substancialmente a ligação do fator nuclear e, consequentemente, aumenta a especificidade da transcrição dependente de T7 RNA Pol em células de mamíferos tanto quanto 10 vezes (117).


Vazamento do promotor T7 - ​​Biologia

F. William Studier, Cientista Sênior Emérito do Laboratório Nacional de Brookhaven, em 2004. Na década de 1980, Studier e uma equipe de colaboradores decifraram detalhes importantes do bacteriófago T7 e transformaram o que aprenderam em um sistema para produzir grandes quantidades de proteínas desejadas. A produção das vacinas de mRNA COVID-19 atuais depende dessas descobertas fundamentais.

Você provavelmente ouviu que as duas primeiras vacinas aprovadas para combater o COVID-19 nos Estados Unidos usam uma abordagem relativamente nova - injeções de pacotes simples contendo mRNA, um material genético que instrui nossas células a produzir proteínas de pico do coronavírus. Mas a tecnologia para gerar quantidades suficientes desses pacotes de mRNA remonta à década de 1980, quando F. William Studier, então um biofísico sênior do Departamento de Energia dos EUA e do Laboratório Nacional de Brookhaven, desenvolveu uma maneira de aproveitar a maquinaria molecular de um vírus muito diferente .

& ldquoO fato de que o conhecimento científico e as ferramentas desenvolvidas décadas atrás agora estão sendo usados ​​para produzir vacinas de mRNA que salvam vidas para COVID-19 é um ótimo exemplo de como os investimentos de longo prazo do Departamento de Energia em pesquisa fundamental em nossos Laboratórios Nacionais podem melhorar a vida dos americanos hoje e no futuro, ”disse o Dr. Steve Binkley, Diretor em exercício do DOE & rsquos Office of Science.

Na década de 1980, Studier, o falecido John Dunn e seu grupo no Departamento de Biologia do Brookhaven Lab & rsquos concluíram o sequenciamento e a anotação do genoma do bacteriófago T7. T7 é um vírus que infecta E. coli bactérias e comanda essas células para fazer cópias do vírus. Ter a sequência completa do genoma ajudou os cientistas a entender como os genes T7 e outros elementos trabalham juntos para reproduzir muitas cópias do vírus.

Pouco depois, Studier e sua equipe encontraram uma maneira de direcionar a prolífica capacidade de cópia do T7 & rsquos para fazer coisas diferentes de mais T7s. Eles clonaram a T7 RNA polimerase & # 8212, a enzima que transcreve genes de DNA em RNA mensageiro (mRNA), que instrui as células a quais aminoácidos se ligam para construir uma proteína específica. A equipe então usou esta T7 RNA polimerase junto com um poderoso promotor T7 (um elemento genético que serve como um sinal & ldquostart & rdquo para a transcrição do gene) para produzir grandes quantidades de RNA a partir de quase qualquer gene. Esses RNAs poderiam ser usados ​​diretamente, como em vacinas baseadas em mRNA, ou entregues a ribossomos (fábricas de produção de proteínas de células) para serem traduzidos em proteínas, como no sistema de expressão de T7.

"Cientistas de todo o mundo têm usado o sistema de expressão Bill & rsquos & lsquoT7 & rsquo para fazer grandes quantidades de proteínas ou RNA de interesse nas últimas quatro décadas", disse Venki Ramakrishnan, bióloga estrutural ganhadora do Prêmio Nobel do Laboratório de Biologia Molecular do Conselho de Pesquisa Médica, em Cambridge, Reino Unido. "As novas vacinas de mRNA COVID-19 usam exatamente esse sistema", disse ele.

Nas fábricas administradas pela Pfizer / BioNTech e Moderna, promotores derivados de T7 e enzimas geram quilos de mRNA de proteína de pico por vez & # 8212 deixando nossas próprias células para fazer a parte de produção de proteína após uma dose de instruções ser injetada em nossos braços .

"O trabalho fundamental" tornou possíveis as vacinas de mRNA que salvam vidas ", disse Ramakrishnan.

Voltar à rotina

Este gráfico simplificado compara a infecção do bacteriófago T7 com o sistema de expressão T7 desenvolvido no Brookhaven Lab na década de 1980 e o uso de elementos genéticos T7 para fazer as vacinas COVID-19 de mRNA de hoje & # 039s. Todos os três usam o promotor T7 como um sinal para iniciar a transcrição do gene e a RNA polimerase derivada de T7 para transcrever o código do DNA em instruções de mRNA que "dizem" aos ribossomos como construir proteínas. Na infecção por T7, o produto são novos vírus (revestimentos de proteínas que encapsulam cópias de DNA de T7 e outras proteínas virais). O sistema de expressão produz uma determinada proteína desejada. Para a vacina, os mRNAs são injetados em nossos braços, onde nosso os ribossomos os usam para fazer proteínas de pico COVID-19. Esses picos livres de vírus treinam nosso sistema imunológico para estar pronto se tivermos que lutar contra o vírus real.

William Studier não tinha nenhuma visão de fazer vacinas quando começou sua pesquisa fundamental sobre o vírus T7 como um estudante de biofísica no Instituto de Tecnologia da Califórnia, nem enquanto continuava essa pesquisa depois de ingressar no Laboratório Brookhaven.

"O T7 não era um bacteriófago bem estudado quando vim para Brookhaven em 1964", disse ele. “Eu o estava usando para estudar as propriedades do DNA e decidi também estudar sua genética e fisiologia molecular. Meu objetivo, é claro, era entender o máximo possível sobre o T7 e como ele funciona. & Rdquo

A clonagem do gene para a T7 RNA polimerase em 1983 foi particularmente difícil, observou Studier.

& ldquoOutros tentaram e falharam. As empresas me perguntaram se tínhamos ”, disse ele. & ldquoNós tínhamos a sequência de DNA na época e pensei que entendia por que a clonagem falhou e como remediar o problema. & rdquo

Studier trabalhou com Parichehre Davanloo, então um pós-doutorado, e Alan Rosenberg, um membro sênior do laboratório, para enfrentar o desafio. John Dunn purificou a T7 RNA polimerase e mostrou que ela produz grandes quantidades de RNA. Barbara Moffatt, então estudante de graduação, trabalhou com Studier para transformar essas descobertas no sistema de expressão T7.

& ldquoO advogado de patentes do Brookhaven Lab sabia o que estávamos fazendo e apresentamos o que acho que foi a primeira patente em Brookhaven sob a Lei Bayh-Dole & rdquo & # 8212 uma lei aprovada pelo Congresso em 1980 que permitia a instituições e conceder aos destinatários direitos de patente e licença para invenções decorrentes de pesquisas financiadas pelo governo, Studier explicou.

O resto é história. O sistema de expressão T7 tornou-se a tecnologia de maior sucesso do Brookhaven Lab & rsquos, com laboratórios de pesquisa em todo o mundo usando-o e centenas de empresas licenciando a tecnologia para fazer produtos. E embora as patentes já tenham expirado, o T7 ainda é o sistema ideal para bioquímicos em todos os lugares.

& ldquoT7 RNA polimerase pode sintetizar grandes quantidades de RNA a partir de qualquer DNA adjacente a um forte promotor T7. Não sei se existe algo comparável ”, disse Studier.

John Shanklin, presidente do Departamento de Biologia do Brookhaven Lab & rsquos, concorda. & ldquoA polimerase T7 e o promotor são tão eficientes que tornam possível produzir mRNA suficiente para milhões de doses de vacina de uma vez. As descobertas de Bill & rsquos desempenharam um grande papel em tornar possível aumentar rapidamente a produção para proteger pessoas em todo o mundo contra o COVID-19. & Rdquo

Duas dessas pessoas vacinadas recentemente são Bill Studier e sua esposa Sue.

"Eu me perguntava casualmente se a T7 RNA polimerase poderia estar envolvida na produção das vacinas de RNA", ponderou Studier, agora biofísico sênior emérito. & ldquoA pesquisa básica é quase sempre útil, e estou satisfeito por meu trabalho ter sido útil na obtenção de vacinas poderosas contra essa pandemia. & rdquo

Apresentação de slides de imagens históricas de William Studier, tiradas em 1970, 1972 (com Polly Winston), 1978 e 1984 (com John Dunn). Passe o mouse sobre a imagem para revelar os controles da apresentação de slides.

F. William Studier obteve um B.S. em biofísica por Yale em 1958, seguido por um Ph.D. do California Institute of Technology em 1963. Ele trabalhou como pós-doutorado no Departamento de Bioquímica da Stanford University School of Medicine e, em seguida, ingressou no Brookhaven Lab & rsquos Biology Department em 1964 como biofísico assistente. Com o passar dos anos, Studier subiu na hierarquia do departamento, recebendo estabilidade em 1971 e tornando-se biofísico sênior em 1974. Ele atuou como chefe do Departamento de Biologia de 1990 a 1999 e depois voltou a pesquisar. Ele também atuou como Professor Adjunto de Bioquímica na Stony Brook University. Suas realizações foram reconhecidas pela eleição para a Academia Americana de Artes e Ciências em 1990, a Academia Nacional de Ciências em 1992 e como membro da Associação Americana para o Avanço da Ciência em 2007. Em 2015 ele foi nomeado Cientista Sênior Emérito no Brookhaven Lab, e foi eleito Fellow da National Academy of Inventors em 2018. Ele possui 15 patentes, das quais 9 foram licenciadas e comercializadas, incluindo as do sistema T7.

A pesquisa da Studier & rsquos no Brookhaven Lab foi apoiada pelo DOE Office of Science (BER).


A ciência por trás do tiro: ferramentas de biotecnologia desenvolvidas no Brookhaven Lab, fundamentais para a fabricação de vacinas COVID-19

25 de maio de 2021 13:16 ET | Fonte: Laboratório Nacional de Brookhaven Laboratório Nacional de Brookhaven

Upton, Nova York, ESTADOS UNIDOS

Upton, NY, 25 de maio de 2021 (GLOBE NEWSWIRE) - Você provavelmente ouviu que as duas primeiras vacinas aprovadas para combater COVID-19 nos Estados Unidos usam uma abordagem relativamente nova - injeções de pacotes simples contendo mRNA, um material genético que instrui nossas células a produzir proteínas de pico do coronavírus. Mas a tecnologia para gerar quantidades suficientes desses pacotes de mRNA data da década de 1980, quando F. William Studier, então um biofísico sênior do Laboratório Nacional de Brookhaven do Departamento de Energia dos EUA, desenvolveu uma maneira de aproveitar a maquinaria molecular de um vírus muito diferente .

“O fato de que o conhecimento científico e as ferramentas desenvolvidas décadas atrás agora estão sendo usados ​​para produzir as vacinas de mRNA que salvam vidas para COVID-19 é um grande exemplo de como os investimentos de longo prazo do Departamento de Energia em pesquisa fundamental em nossos Laboratórios Nacionais podem melhorar a vida dos americanos hoje e no futuro ”, disse o Dr. Steve Binkley, Diretor Interino do Escritório de Ciência do DOE.

Na década de 1980, Studier, o falecido John Dunn e seu grupo no Departamento de Biologia do Laboratório de Brookhaven concluíram o sequenciamento e anotaram o genoma do bacteriófago T7. T7 é um vírus que infecta E. coli bactérias e comanda essas células para fazer cópias do vírus. Ter a sequência completa do genoma ajudou os cientistas a entender como os genes T7 e outros elementos trabalham juntos para reproduzir muitas cópias do vírus.

Pouco tempo depois, Studier e sua equipe encontraram uma maneira de direcionar a prolífica capacidade de cópia do T7 para fazer coisas diferentes de mais T7s. Eles clonaram a T7 RNA polimerase - a enzima que transcreve genes de DNA em RNA mensageiro (mRNA), que instrui as células a quais aminoácidos se ligam para construir uma proteína específica. A equipe então usou esta T7 RNA polimerase junto com um poderoso promotor T7 (um elemento genético que serve como um sinal de “início” para a transcrição do gene) para produzir grandes quantidades de RNA a partir de quase qualquer gene. Esses RNAs podem ser usados ​​diretamente, como em vacinas baseadas em mRNA, ou entregues aos ribossomos (fábricas de produção de proteínas das células) para serem traduzidos em proteínas, como no sistema de expressão de T7.

“Cientistas de todo o mundo têm usado o 'sistema de expressão T7' de Bill para fazer grandes quantidades de proteínas ou RNA de interesse nas últimas quatro décadas”, disse Venki Ramakrishnan, biólogo estrutural vencedor do Prêmio Nobel do Laboratório de Pesquisa Molecular do Medical Research Council Biology, em Cambridge, Reino Unido. “As novas vacinas de mRNA COVID-19 usam exatamente esse sistema”, disse ele.

Nas fábricas administradas pela Pfizer / BioNTech e Moderna, promotores derivados de T7 e enzimas geram quilos de mRNA de proteína de pico de cada vez - deixando nossas próprias células fazerem a parte da produção de proteínas depois que uma dose de instruções é injetada em nossos braços .

“O trabalho fundamental de Bill tornou possíveis as vacinas de mRNA que salvam vidas”, disse Ramakrishnan.

William Studier não tinha nenhuma visão de fazer vacinas quando começou sua pesquisa fundamental sobre o vírus T7 como um estudante de biofísica no Instituto de Tecnologia da Califórnia, nem enquanto continuava essa pesquisa depois de ingressar no Laboratório Brookhaven.

“T7 não era um bacteriófago bem estudado quando vim para Brookhaven em 1964”, disse ele. “Eu estava usando para estudar propriedades do DNA e decidi estudar também sua genética e fisiologia molecular. Meu objetivo, é claro, era entender o máximo possível sobre o T7 e como ele funciona. ”

A clonagem do gene para a T7 RNA polimerase em 1983 foi particularmente difícil, observou Studier.

“Outros tentaram e falharam. As empresas me perguntaram se tínhamos ”, disse ele. “Tínhamos a sequência de DNA na época e achei que entendia por que a clonagem falhou e como remediar o problema.”

Studier trabalhou com Parichehre Davanloo, então um pós-doutorado, e Alan Rosenberg, um membro sênior do laboratório, para enfrentar o desafio. John Dunn purificou a T7 RNA polimerase e mostrou que ela produz grandes quantidades de RNA. Barbara Moffatt, então estudante de graduação, trabalhou com Studier para transformar essas descobertas no sistema de expressão T7.

“O advogado de patentes do Brookhaven Lab sabia o que estávamos fazendo e registramos o que eu acho que foi a primeira patente em Brookhaven sob a Lei Bayh-Dole” - uma lei aprovada pelo Congresso em 1980 que permitia que instituições e concedessem aos destinatários direitos de patente e licença para invenções originadas de pesquisas financiadas pelo governo, explicou Studier.

O resto é história. O sistema de expressão T7 tornou-se a tecnologia de maior sucesso do Brookhaven Lab, com laboratórios de pesquisa em todo o mundo usando-o e centenas de empresas licenciando a tecnologia para fazer produtos. E embora as patentes já tenham expirado, o T7 ainda é o sistema ideal para bioquímicos em todos os lugares.

“A polimerase de RNA T7 pode sintetizar grandes quantidades de RNA a partir de qualquer DNA adjacente a um promotor T7 forte. Não sei se existe algo comparável ”, disse Studier.

John Shanklin, presidente do Departamento de Biologia do Laboratório Brookhaven, concorda. “A polimerase T7 e o promotor são tão eficientes que possibilitam a produção de mRNA suficiente para milhões de doses de vacina ao mesmo tempo. As descobertas de Bill desempenharam um grande papel em tornar possível aumentar rapidamente a produção para proteger as pessoas em todo o mundo do COVID-19. ”

Duas dessas pessoas vacinadas recentemente são Bill Studier e sua esposa Sue.

“Eu me perguntei casualmente se a polimerase de RNA T7 poderia estar envolvida na produção das vacinas de RNA”, ponderou Studier, agora um biofísico sênior emérito. “A pesquisa básica é quase sempre útil e estou satisfeito que meu trabalho tenha sido útil na obtenção de vacinas poderosas contra esta pandemia.”

F. William Studier obteve um B.S. em biofísica por Yale em 1958, seguido por um Ph.D. do Instituto de Tecnologia da Califórnia em 1963. Ele trabalhou como pós-doutorado no Departamento de Bioquímica da Escola de Medicina da Universidade de Stanford e, em seguida, ingressou no Departamento de Biologia do Laboratório de Brookhaven em 1964 como biofísico assistente. Ao longo dos anos, Studier subiu na hierarquia do departamento, recebendo estabilidade em 1971 e tornando-se biofísico sênior em 1974. Ele atuou como chefe do Departamento de Biologia de 1990 a 1999 e depois voltou a pesquisar. Ele também atuou como Professor Adjunto de Bioquímica na Stony Brook University. Suas realizações foram reconhecidas pela eleição para a Academia Americana de Artes e Ciências em 1990, a Academia Nacional de Ciências em 1992 e como membro da Associação Americana para o Avanço da Ciência em 2007. Em 2015 ele foi nomeado Cientista Sênior Emérito no Brookhaven Lab, e foi eleito Fellow da National Academy of Inventors em 2018. Ele possui 15 patentes, das quais 9 foram licenciadas e comercializadas, incluindo as do sistema T7.

A pesquisa de Studier no Brookhaven Lab foi apoiada pelo DOE Office of Science (BER).


Bioquímica e Biologia Molecular

4.14.3.3.1.2 Bombyx mori promotor de actina citoplasmático

Um poderoso cassete de expressão de lepidópteros, pIE1 / 153A, foi desenvolvido recentemente no laboratório do Dr. Kostas Iatrou na Universidade de Calgary. A cassete utiliza a mariposa da seda ( B. mori) promotor do gene da actina citoplasmática (Mounier e Prudhomme, 1986 Johnson et al., 1992), um dos promotores celulares constitutivos mais fortes que também é ativo em uma variedade de linhas de células de lepidópteros transfectadas. A transcrição deste promotor celular foi surpreendentemente estimulada pelo produto do gene precoce imediato (ie-1) de BmNPV, IE-1, um fator de transcrição capaz de estimular o em vitro taxa de transcrição do promotor de actina em trans em até 100 vezes (Lu et al., 1996). A estimulação do promotor da actina em até duas ordens de magnitude também foi obtida pela ligação em cis a região de repetição homóloga 3 (HR3) de BmNPV em várias orientações em relação ao promotor de actina (Lu et al., 1997). Ligação do ie-1 gene e o elemento potenciador HR3 com o promotor do gene da actina no cassete de expressão pIE1 / 153A resultou em uma estimulação da expressão do gene estranho dirigido pelo promotor da actina em aproximadamente 5000 vezes em ensaios de expressão transiente para duas proteínas repórter (Lu et al., 1997). Linhas celulares estáveis ​​foram geradas por cotransfecção das células com a cassete de expressão e um segundo plasmídeo que confere resistência a higromicina B, puromicina ou G418. Os níveis de expressão relatados de proteínas secretadas de linhas de células estáveis ​​transformadas com este sistema excederam, de longe, aqueles obtidos pelo sistema de expressão de baculovírus (Farrell et al., 1998 Farrell et al., 1999). Além disso, o plasmídeo de expressão funciona em uma ampla variedade de linhas de células de lepidópteros, incluindo aquelas derivadas de B. mori, T. ni, Plodia interpuntella, L. dispar, Mamestra brassicae, C. fumiferana, e S. frugiperda (Keith et al., 1999). O cassete de expressão também é adequado para protocolos de expressão transitória ampliados que podem render dezenas de miligramas de proteína recombinante por litro em 5 dias pós-transfecção (Farrel e Iatrou, 2004) (Figura 5), ​​evitando assim o processo demorado e trabalhoso de seleção estável de antibióticos e clonagem de altos expressores. Os derivados da cassete de expressão pIE1 / 153A estão disponíveis no Dr. Iatrou.

Figura 5. Expressão transitória e purificação por afinidade de fosfatase alcalina secretada humana marcada com histidina (SEAP gentilmente fornecido por Eric Carpentier e Amine Kamen, Biotechnology Research Institute, Montreal, Canadá) a partir de uma transfecção mediada por lipofectina de células High Five ™ em cultura em suspensão usando o pIE1 / 153A cassete de expressão. Em comparação com uma série de padrões de massa de albumina sérica bovina no gel corado com azul de Coomassie, aproximadamente 50 μg ml −1 de SEAP estava presente no sobrenadante de cultura 5 dias após a transfecção e produção em meio sem proteína ESF-921 (pista marcada “+” Em comparação com o controle marcado com “-”). Dois miligramas de SEAP foram recuperados de uma fração de eluição (E) após purificação por afinidade de íon Ni de 50 ml de sobrenadante de cultura.


Vazamento do promotor T7 - ​​Biologia

Imagem: Mapa de plasmídeo ilustrado em formato PNG

Arquivo GenBank: Sequência de plasmídeo e anotações. Use editor de texto ou software de mapeamento de plasmídeo para visualizar a sequência.

Arquivo SnapGene: Sequência de plasmídeo e anotações aprimoradas de SnapGene. Use com o software SnapGene ou o Viewer gratuito para visualizar dados adicionais e alinhar outras sequências.

Mapa de sequência completa de addgene para pCMV-T7-EGFP (BPK1098)

Imagem do mapa para pCMV-T7-EGFP (BPK1098)

Mapa carregado pelo depositante.

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Expressão do promotor T7 - (19 / jun / 2011)

Tenho um lenço para discutir com todos e estou ansioso para compartilhar a ajuda de todos vocês. Atualmente, estou conduzindo um estudo do vetor de expressão de design dos genes que codificam a biossíntese da enzima licopeno em E. coli. Aqui, a expressão de vetor que utilizo é as cepas pRSET-A e alfa DH5 alfa como a célula hospedeira. No pRSET-A, o gene será ligado ao sistema controlado pelo promotor T7, este promotor necessita da transcrição da enzima T7 RNA polimerase para ocorrer. Isso na cepa DH5 alfa sem esta enzima. Porém, obtivemos a expressão das colônias de licopeno. Então, por que isso acontece?

Tem um "lenço de papel"? hahaha. desculpe, apenas brincando

Primeiro você confirmou que DH5 alfa não tem os genes que codificam a biossíntese da enzima licopeno ?. Eu estava supondo que DH5 alfa contém esse gene. então, quando você verificar a expressão, é claro que obterá a proteína. É muito importante obter compatibilidade entre o plasmídeo hospedeiro. Se você deseja expressar algum gene em e.coli, certifique-se de que existe tal gene naquele hospedeiro. Se você não tiver certeza de que o DH5alpha contém esse gene, primeiro tente cultivar a célula

1. Verifique a expressão de DH5alfa sem plasmídeo.
2. verificar a expressão de DH5 alfa com o plasmídeo pRSET-A (sem IPTG adicionado)
3. Faça uma expressão de DH5 alfa com o plasmídeo PRSER-A e adicione algum IPTG conc

Ok, o que esperamos disso:
se você obtiver a banda para todas as vias, o mesmo nível de expressão médio ... o tipo selvagem de DH5alpha contém o gene que codifica a enzima,
se você obtiver a expressão (3.) obter mais espessa significa que o promotor T7 realmente funciona, como todos nós sabemos que o T7 pode ser induzido pela presença de IPTG. se você ver que não há diferença entre (2) e (3) ... significa que a polimerase T7 não é o problema aqui (nem mesmo um tecido. lol brincando apenas). veio do hospedeiro. o hospedeiro é capaz de expressar o gene (porque o gene está no genoma com o promotor original).

então se for esse o caso, tente usar o hospedeiro outro E. coli que perder esse gene. Eu te disse claramente? host correto irá mostrar a você o diferente antes e depois de induzir com IPTG

Isso é o que me passou pela cabeça

Não acho que E. coli produz licopeno nativamente, mas posso estar errado. Mais provavelmente, você tem uma transcrição acontecendo de um promotor que você não identificou. This could be a cryptic promoter in your operon, or read-through transcription from a promoter on the plasmid. You might try putting your operon in the reverse orientation in your plasmid. Or changing plasmids to one that reduces this read-through (Lucigen makes some, I believe).

I don't understand. how can putting the operon in reverse orientation in the plasmid can help?

p/s: hmn. lucigen. lately I heard people talked about it quite frequently. a new company?

If you have transcription activity arising from the plasmid, then the direction of the insert can determine if the transcript is in the sense or anti-sense direction. Lucigen is a U. Wisconsin Madison spinout that has been around for about 5-7 years, I think. They make a series of interesting cloning vectors.


Optimization of a T7-RNA polymerase system in Synechococcus sp. PCC 7002 mirrors the protein overproduction phenotype from E. coli BL21(DE3)

With the goal of expanding the diversity of tools available for controlling gene expression in cyanobacteria, the T7-RNA polymerase gene expression system from E. coli BL21(DE3) was adapted and systematically engineered for robust function Synechococcus sp. PCC 7002, a fast-growing saltwater strain. Expression of T7-RNA polymerase was controlled via LacI regulation, while functionality was optimized by both further tuning its expression level along with optimizing the translation initiation region of the expressed gene, in this case an enhanced YFP reporter. Under high CO2 conditions, the resulting system displayed a 60-fold dynamic range in expression levels. Furthermore, when maximally induced, T7-RNA polymerase-dependent protein production constituted up to two-thirds of total cellular protein content in Synechococcus sp. PCC 7002. Ultimately, however, this came at the cost of 40% reductions in both biomass and pigmentation levels. Taken together, the developed T7-RNA polymerase gene expression system is effective for controlling and achieving high-level expression of heterologous genes in Synechococcus sp. PCC 7002, making it a valuable tool for cyanobacterial research.

Pontos chave

• Promoter driving T7-RNA polymerase was optimized.

• Up to 60-fold dynamic range in expression, depending on CO 2 condições.


DISCUSSÃO

The conditional lethal system presented here consists of the streptavidin gene as a key suicide element. The biotin-binding ability of streptavidin in P. putida is notable because it requires not only proper peptide folding but also formation of the correct tetrameric structure. So far, there are only several genes that have been proven to be bactericidal upon expression in the members of genus Pseudomonas. These are genes encoding cell membrane destabilizing peptides Hok (E. coli plasmid R1) (22) and Gef (E. coli) (23), lysis genes of bacteriophages λ and φX174 (24), and the colE3 gene encoding an RNase (E. coli) (25). It is also worth mentioning that the T7 lysozyme maintains its T7 RNA polymerase inhibition ability in a heterologous P. putida sistema.

The rate of inactivation, a basic determinant of the efficiency of suicide designs, in our stv-based system is 10 −7 –10 −8 per cell per generation. This value is lower than those already reported for constructs based on single toxic functions (10 −2 –10 −6 ), even in E. coli, which is easier to contain (9, 23, 26, 27). It apparently reflects the very low basal level of streptavidin in cells. Despite the fact that the coupled T7 transcription/LacI-Olaca system is less leaky than the laca system alone (Table 1), an additional explanation of the better protection of cells against uninduced expression of the stv gene is synthesis of the antisense RNA originating from the Pm promotor. The lack of such protection, especially without a transcription terminator (e.g., LacI-Olaca complex) upstream of φ10 as in pVLTΔ-s02, resulted in a remarkably higher mutation frequency of 10 −4 –10 −5 per cell per generation. The LacI-Olaca complex formed upstream of the φ10 in pCC-s04 apparently interferes also with binding of bacteriophage RNA polymerase to the φ10 promoter (slower induction of the stv gene expression upon removal of 3MB) and further decreases the frequency of appearance of killing-resistant clones by reducing uninduced transcription of the stv gene. Preliminary data on the killing of E. coli by IPTG-induced expression of the stv gene suggest that, as expected, this system should be effective also in enteric bacteria.

A temperature shift from 30°C to 20°C alters the kinetics of the culture decay. This effect was more pronounced in a bacterial population depleted of 3MB in the absence of IPTG, indicating a contribution of both weaker interaction of T7 RNA polymerase with φ10 and the longer lifetime of the LacI repressor and/or its mRNA within a cell. Continuing decline of the culture after the addition of IPTG indicates a lower rate of mutational inactivation of the construct at 20°C than at 30°C.

The suicide design was tested under rich nutrient conditions—i.e., in LB medium containing some biotin. The growth conditions were favorable for cell survival, since killing occurs by depletion of biotin. In fact, slightly higher levels of IPTG-induced cell death were observed in minimal M9 medium (not shown). Under mostly starving conditions in, for instance, soil or seawater, this system may perform even more effectively. UMA SmaI fragment of pCC-s05 containing xylS2, lacI, e stv genes (Fig. 2B) has been already stably integrated into P. putida chromosome via mini-Tn5-mediated transposition (data not shown). Other known killing genes will be placed under control of φ10 promoter and integrated into the chromosome of P. putida <hsdR1 stv lacI xylS2 Kan r > to create multiple back up systems following incorporation of the T7 RNA polymerase-lysozyme regulatory module. Alternatively, stability of pRO-ilp upon induction of suicide in the absence of selection for plasmid maintenance can be achieved, for instance, by inserting into it the parB (hok/sok) locus of R1.

To summarize, additional regulatory circuits arranged to reduce the basal level of the expression of killing gene can remarkably increase the effectiveness of cell suicide machinery. Because of the general demand of biotin as a carboxyl carrier in the living world, the stv gene can serve as a universal cassette for programmed cell death. o stv-based system in combination with, for example, biotinylated solid supports and biotinylated fluorescent probes could also allow very sensitive monitoring of the presence of recombinant microorganisms.


Assista o vídeo: Dica de como instalar uma válvula termostática, pq não tirar a válvula termostática (Agosto 2022).