Em formação

Plasmídeo escolhendo

Plasmídeo escolhendo


We are searching data for your request:

Forums and discussions:
Manuals and reference books:
Data from registers:
Wait the end of the search in all databases.
Upon completion, a link will appear to access the found materials.

Para projetar um experimento na alimentação de C. elegans. Ele tem que escolher um vetor de plasmídeo para inserir o gene de interesse que pode alimentar C. elegans. Muitos jornais estão usando pL4440 para o vetor de alimentação, dizendo que é o primeiro usado na alimentação de C. elegan e por causa dos dois promotores T7, por isso é fácil de realizar o experimento. Há também um artigo dizendo que o promotor T3 não é adequado para alimentação em C. elegans. Estou curioso para saber por que o T3 não é adequado? e porque não vi muitos papéis usando outro vetor para realizar o experimento de alimentação em C. elegan. Então eu me pergunto se eu escolher um plasmídeo que tenha dois promotores T7 e seja usado para se expressar em vermes como o pLT61, isso influenciará a alimentação ou a eficiência para que as pessoas usem o pL4440 para alimentação em C.elegan? Ou as pessoas usam o vetor pL4440 porque ele é específico para o experimento de alimentação de C. elegan? Obrigado!


PREFÁCIO: Há um texto, C. elegans: métodos e aplicações, especificamente doi: 10.1385 / 1-59745-151-7: 109. Eles descrevem esse experimento exato em sua essência, e um dos diagramas (página 110) observa que, para fins de RNAi em C. elegans, o promotor T3 especificamente não funciona para o método de alimentação bacteriana, mas funciona para procedimentos de injeção ou imersão. Eu absolutamente não consigo descobrir por que isso acontece especificamente, mas vou continuar pesquisando.

ATUALIZADO: Muito obrigado a mdperry por esclarecer as coisas! Acontece que isso é uma questão de projeto experimental. Usando informações de A ingestão de dsRNAs expressos em bactérias pode produzir interferência genética potente e específica em Caenorhabditis eleganse Source Bioscience:

HT115 (DE3) é uma cepa de alimentação projetada dessa forma,

O genótipo é o seguinte: F-, mcrA, mcrB, IN (rrnD-rrnE) 1, lambda -, rnc14 :: Tn10 (DE3 lisogênio: promotor lavUV5 -T7 polimerase) (polimerase T7 induzível por IPTG) (RNase III menos) . Esta cepa cresce em placas LB ou 2xYT (e é resistente à tetraciclina, veja abaixo), e células competentes podem ser feitas usando técnicas padrão.

Podemos passar por eles e observar as mudanças também:

F- significa nenhum plasmídeo F para conjugação. mcrA / B refere-se a mutações feitas que reduzem a capacidade da E. coli de atacar DNA estranho. IN (rrnD-rrnE) 1 é uma inversão na região de alguns operons de rRNA que não tenho certeza quanto ao efeito. Lambda- remove o lisogênio lambda. Você pode ver que eles têm o promotor lavUV5 para uma polimerase T7 induzível por IPTG, que é importante para fazer com que a E. coli comece a produzir polimerase T7 para expressar o vetor de clonagem associado. Você também pode ver que HT115 (DE3) é deficiente para RNase III, que normalmente degrada o dsRNA, tornando-o adequado para o experimento de alimentação.

O vetor de clonagem L4440 (pPD129.36) contém dois promotores de polimerase T7 convergentes em orientação oposta separados por um local de multiclonagem e foi feito usando técnicas de clonagem padrão (Timmons e Fire, 1998).

pLT61 contém 0,8 kb de unc-22 inserido no vetor L4440.

Acho que o plasmídeo L4440 é provavelmente fácil de otimizar para este experimento e barato. Se você pode acessar o artigo que eu linkado acima, eles catalogam alguns plasmídeos adicionais. Em conclusão, porém, parece que se de fato tivéssemos um sistema em que a própria E. coli pudesse produzir a T3 polimerase, não haveria problema em usar esses promotores. No caso deste experimento, o genótipo da cepa de alimentação da bactéria complementa muito bem o vetor que está sendo usado.


Plasmídeos 101

Os plasmídeos são pedaços circulares de DNA encontrados em células bacterianas que se replicam independentemente do cromossomo do hospedeiro. Eles são ferramentas poderosas e onipresentes que tocam quase todas as áreas da pesquisa biológica. Em geral, os plasmídeos são usados ​​para expressar genes específicos em células-alvo, introduzir novos elementos e podem ser usados ​​em uma variedade de outras manipulações genéticas. Nesta seção do blog, aprenda mais sobre as diferentes partes de um plasmídeo, técnicas de clonagem molecular, dicas para usar plasmídeos, ferramentas específicas baseadas em plasmídeo e muito mais.


Na maioria dos casos, um vetor de plasmídeo de alta cópia é a melhor abordagem para produzir os maiores rendimentos. Por exemplo, pBluescript tem um número de cópias 300-500 e pUC pode chegar a 700. Você pode estar se perguntando, então, por que alguns plasmídeos têm um valor mais modesto de número de cópias 10-12, como é o caso de pACYC. Esses vetores mais especializados foram desenvolvidos para neutralizar alguns problemas causados ​​por plasmídeos de alta cópia. Seu fragmento de DNA pode, por exemplo, se tornar tóxico para a célula quando presente em níveis elevados. Nesse caso, a melhor maneira de evitar problemas pode ser usar um vetor de baixa cópia.

Uma etapa crucial durante o processo de clonagem é a ligação do fragmento de DNA ao plasmídeo. Isso é muito facilitado pelo uso de endonucleases de restrição específicas. Isso significa que é importante verificar se o plasmídeo e as enzimas de restrição selecionadas são compatíveis. Na realidade, isso não é tão problemático hoje em dia, já que a maioria dos vetores modernos inclui um trecho artificial de DNA com muitos locais de corte de endonuclease de restrição diferentes. Se tudo mais falhar, as ligaduras de extremidade romba são possíveis, mas podem ser muito difíceis de concluir com êxito.


Características dos diferentes Agrobacterium vetores

Dois avanços importantes feitos Agrobacterium transformação o método de escolha para a transformação de plantas.

  • A remoção de todos os genes do T-DNA não impede o Agrobacterium capacidade de transferir DNA, mas impede a formação de tumores. Isso permitiu que os cientistas produzissem "cepas desarmadas".
  • Os dois componentes principais para um Agrobacterium plasmídeo, o T-DNA e a região de virulência (vir) podem residir em plasmídeos separados. Esses componentes formam a base dos vetores plasmídeos Ti modernos, denominados vetores Ti binários.

O T-DNA tem um tamanho de aproximadamente 10 a 30 kbp (cerca de 10% do tamanho do plasmídeo). Alguns plasmídeos podem conter mais de uma região de T-DNA. Além disso, o plasmídeo contém cerca de 35 genes de virulência responsáveis ​​pelo processamento do T-DNA e sua subsequente exportação da bactéria para a célula vegetal.

Maioria em vitro técnicas de manipulação de genes usam E. coli para aumentar o rendimento do plasmídeo, pois é uma bactéria de crescimento rápido. Consequentemente, uma vantagem de trabalhar com vetores binários Ti é a sua capacidade de se replicar em ambos E. coli e Agrobacterium.

Vamos falar sobre as diferentes Agrobacterium vetores usados ​​na transformação de plantas.

Vetor binário

Embora o termo vetor binário literalmente se refira a todo o sistema que consiste em dois replicons (moléculas de DNA), um para o T-DNA e outro para os genes de virulência, o plasmídeo que carrega o T-DNA é freqüentemente chamado de vetor binário. Por conveniência, sigo a definição literal de dois plasmídeos para dar mais detalhes ao leitor.

Um vetor binário consiste em dois plasmídeos: um plasmídeo Ti desarmado carregando a região do T-DNA e um plasmídeo auxiliar contendo os genes de virulência.

O plasmídeo Ti desarmado:

O plasmídeo Ti desarmado consiste em um T-DNA e no esqueleto do vetor (Figura 2A). Ambos os componentes possuem genes diferentes que, juntos, determinam a sequência de DNA a ser transferida e auxiliam na identificação do tecido ou planta transformada. Abaixo, descrevo cada um desses dois componentes presentes no plasmídeo Ti desarmado.

Tabela 1. Componentes do plasmídeo Ti desarmado.

a borda direita (RB) e a borda esquerda (LB) podem vir dos plasmídeos Octapina e Nopalina Ti.

Funções de replicação de plasmídeo

É uma replicação de origem a ser replicada em E. coli e UMA. Tumefaciens. Para UMA. Tumefaciens temos IncP, IncW, pVS1 e pRi. Para E. coli, temos pUC, ColE1, IncP, fator F e Phage P1.

Os plasmídeos pUC e pBluescript contêm múltiplos locais de clonagem.

Marcador bacteriano selecionável

Pode ser canamicina, ampicilina, gentamicina, espectinomicina, cloranfenicol e tetraciclina.

Pode ser canamicina, higromicina, fosfinotricina, glifosato, fosfomanose isomerase

Funções de mobilização de plasmídeo

Eles suportam funções de mobilização de T-DNA, como OriT e Bom

Pode ser uma proteína fluorescente GUS, LUC, GFP

Os promotores constitutivos geralmente conduzem os genes marcadores selecionáveis. Eles incluem CamV 35S, genes T-DNA, ubiquitina e genes de actina.

O plasmídeo auxiliar:

Existem vários genes de virulência, denominados virA, virB, virC, etc., todos produzindo proteínas diferentes que têm papéis diferentes na transferência de T-DNA de Agrobacterium ao seu host (Figura 2B). Abaixo um gráfico que descreve as principais funções desempenhadas por cada gene.

Mesa 2. Descrição das funções dos genes de virulência no Agrobacterium plasmídeo auxiliar.

Detecta compostos fenólicos e induz a expressão de genes de virulência

Importante no sistema de secreção. Necessário para exportação de complexo T para a célula

Promove a síntese de fita T de alta eficiência

Funções topoisomerase e endonuclease, respectivamente

Função de acompanhante. Proteja a fita T do ataque de nuclease.

Figura 2. Componentes do vetor binário. A) Plasmídeo Ti desarmado. B) Plasmídeo auxiliar. Marcador B: marcador selecionável bacteriano LB: Mob da borda esquerda: Função de mobilização MSC: Locais de clonagem múltipla Ori A: função de replicação para Agrobacterium Ori E: função de replicação para E. coli Marcador P: Marcador selecionável de planta Pro: Promotor RB: Borda direita Rep: Gene repórter.

Vetor superbinário

A descoberta de que alguns dos genes de virulência exibiam efeitos de dosagem de genes levou ao desenvolvimento de um vetor superbinário, que carregava genes de virulência adicionais. O sistema de vetor superbinário tem a mesma estrutura do vetor binário, mas também tem um segmento de DNA adicional que contém genes de virulência como virB, virC e virG de pTiBo542 e é introduzido no pequeno plasmídeo portador de T-DNA. Esta região também é chamada de "S vir". O adicional vir os genes levaram a uma alta eficiência na transformação de várias plantas, especialmente plantas recalcitrantes, como cereais importantes.

Figura 3. Componentes do vetor superbinário. S vir (em vermelho) é o segmento adicional carregando genes de virulência e isso se diferencia com o vetor binário.

Vetor ternário

O vetor ternário é um novo sistema proposto por Anand et al. (2018) usando um terceiro plasmídeo - denominado "plasmídeo acessório" ou "plasmídeo auxiliar de virulência" - para transportar um cluster de gene de virulência adicional. O sistema de vetor ternário é um sistema de três componentes com um plasmídeo Ti desarmado, um plasmídeo auxiliar e um plasmídeo de virulência acessório.

O plasmídeo Ti desarmado:

O plasmídeo Ti desarmado é composto pela região do T-DNA flanqueada pelo RB e LB, uma origem de replicação (ori) para Agrobacterium (por exemplo, pVS1 ou pRiA4) e outro ori para E. coli (pUC) e um marcador selecionável de planta (geralmente canamicina).

O plasmídeo auxiliar:

O plasmídeo auxiliar tem um vir região, um marcador selecionável bacteriano (str, estreptomicina), regiões tra / trb que funcionam na transferência conjugacional dos plasmídeos Ti e, se presente, uma região repABC / repAʹBʹCʹ com função na replicação dos plasmídeos Ti.

O plasmídeo de virulência acessório:

O plasmídeo de virulência acessório consiste em um ori para Agrobacterium (por exemplo, pVS1 ou pRiA4) e um ori para E. coli (pUC ori) e um marcador selecionável bacteriano (spe, espectinomicina), e uma grande região de virulência.

O sistema de vetor ternário quase dobra a eficiência de transformação em linhagens consanguíneas de milho recalcitrante (Anand et al., 2018). O sistema ternário também facilitou Agrobacterium transformação de sorgo (Sorghum bicolor) e foi usado para desenvolver protocolos de transformação para variedades africanas populares, mas recalcitrantes (Che et al., 2018).

Figura 4. Componentes do vetor ternário. o plasmídeo acessório é o novo componente no vetor ternário e isso se diferencia dos vetores anteriores. Tra / trb: ativadores transcricionais rep ABC: origem de replicação ABC.

Tabela 3. Comunalidades e diferenças entre os Agrobacterium vetores.

Tem um plasmídeo auxiliar contendo genes de virulência

Possui genes de virulência adicionais no plasmídeo portador de T-DNA

Funciona bem em monocotiledôneas e plantas recalcitrantes

Possui um plasmídeo auxiliar auxiliar contendo uma grande região de virulência

Causa uma infecção intensa em algumas plantas monocotiledôneas e recalcitrantes


O que é um mapa de plasmídeo

Um mapa de plasmídeo é uma representação gráfica de um plasmídeo, que mostra as localizações dos principais pontos de referência ou elementos do plasmídeo. As posições relativas dos elementos dentro de um plasmídeo podem ser identificadas por mapeamento de restrição. Um mapa de restrição é um mapa de locais de reconhecimento de restrição dentro de um plasmídeo particular. Portanto, está envolvido na digestão do plasmídeo por enzimas de restrição. Um mapa de restrição é mostrado em figura 1.

Figura 1: Mapa de restrição

Dois métodos podem ser usados ​​no mapeamento de restrição:

1. Digestão de restrição

& # 8211 Digestão de restrição do plasmídeo com uma ou duas enzimas de restrição

& # 8211 Mapeamento do plasmídeo com base nos tamanhos dos fragmentos resultantes do plasmídeo

2. Sequenciamento

& # 8211 Sequenciando todo o plasmídeo

& # 8211 Identificação dos elementos do plasmídeo


Soluções RBSE para Biologia Classe 12 Capítulo 15 Engenharia Genética

RBSE Class 12 Biology Capítulo 15 Questões de múltipla escolha

Questão 1.
Qual das seguintes enzimas corta o DNA em um local específico?
(a) Ligase
(b) Polimerase
(c) Endonuclease de Restrição
(d) Todas as opções acima
Responder:
(c) Endonuclease de Restrição

Questão 2.
A enzima endonuclease de restrição é encontrada naturalmente em?
(a) Bactérias
(b) Vírus
(c) Plantas
(d) Animais
Responder:
(a) Bactérias

Questão 3.
DNA Vector é?
(a) Plasmídeo
(b) cDNA
(c) DNA sintetizado
(d) Todas as opções acima
Responder:
(a) Plasmídeo

Questão 4.
M13 é um exemplo de?
(a) Plasmídeo
(b) Bacteriófago
(c) Cosmídeo
(d) Todas as opções acima
Responder:
(b) Bacteriófago

Questão 5.
Qual das técnicas de Blotting é usada na identificação de segmentos de DNA?
(a) DNA genômico
(b) Ocidental
(c) Sul
(d) Norte
Responder:
(c) Sul

Questão 6.
Qual enzima une as extremidades livres do DNA?
(a) Endonuclease de restrição
(b) Ligases
(c) lisozima
(d) Todas as opções acima
Responder:
(b) Ligases

Questão 7.
Os genes saltadores são chamados?
(a) Phasmid
(b) Plasmídeo
(c) Cosmídeo
(d) Transposons
Responder:
(d) Transposons

Questão 8.
Mullis descoberto em 1989?
(a) Plasmídeo
(b) Reação em cadeia da polimerase
(c) Técnica de Southern Blotting
(d) Técnica de Western Blotting
Responder:
(b) Reação em cadeia da polimerase

Questão 9.
O C-DNA é usado na formação de?
(a) tRNA
(b) mRNA
(c) rRNA
(d) DNA
Responder:
(b) mRNA

Questão 10.
Qual das alternativas a seguir é uma fonte de EcoRI?
(a) Bactérias
(b) Algas
(c) Planta
(d) Todas as opções acima
Responder:
(a) Bactérias

RBSE Class 12 Biology Capítulo 15 - Resposta Muito Curta

Questão 1.
Quem é creditado por desenvolver a Técnica de DNA recombinante (RDT)?
Responder:
Stanley Cohen, Herbert Boyer et al (1973).

Questão 2.
Definir tecnologia de DNA recombinante?
Responder:
Várias medidas eficazes necessárias para incorporar mudanças na composição do DNA de qualquer organismo são chamadas de tecnologia de DNA recombinante.

Questão 3.
O que são vetores de clonagem?
Responder:
Na tecnologia de DNA recombinante, a fim de introduzir o gene desejado na planta / animal alvo, é necessário um transportador que pode transportar o gene desejado e pode entrar na planta / animal alvo e replicar seu DNA. Essa portadora é chamada de vetor. Plasmídeos, bacteriófagos e cosmídeos são usados ​​como vetores na tecnologia de DNA recombinante.

Questão 4.
O que se entende por sondas moleculares?
Responder:
Os segmentos de DNA ou RNA com a ajuda dos quais segmentos C-DNA ou RNA de algum organismo podem ser identificados são chamados de sondas moleculares.
As sondas moleculares são dos seguintes tipos:

Questão 5.
O que são genes marcadores? Escreva exemplos.
Responder:
Quando o gene desejado é incorporado ao vetor, vários produtos indesejados também são obtidos. A fim de eliminar esses produtos indesejados e identificar o DNA recombinante na célula hospedeira, um tipo especial de gene é usado. Isso produz recursos especiais nas células modificadas / transformadas. Este gene incorporado no DNA do vetor é denominado gene marcador.
Exemplo: gene resistente à canamicina.

Questão 6.
O que são genes repórter? Dar exemplos.
Responder:
Além dos genes marcadores, existem certos genes que produzem ou apresentam algumas características específicas na célula hospedeira. Esses são chamados de genes repórter. Esses genes produzem um efeito especial por causa do qual as células que contêm esses genes parecem diferentes das outras células.
Exemplo: gene LUC encontrado na mosca de fogo (& # 8220Jugnoo & # 8221) e produz bioluminescência.

Questão 7.
Qual é a biblioteca genômica?
Responder:
A coleção de segmentos clonados de todo o genoma de qualquer organismo é chamada de biblioteca genômica. Uma biblioteca genômica é formada retirando o conteúdo completo de DNA do conjunto haplóide de cromossomos de um organismo.

Questão 8.
O que são Cosmids?
Responder:
Os cosmídeos são um híbrido de plasmídeo e fago 2 (Lambda). Esses plasmídeos, nos quais a sequência de DNA do local & # 8216Cos & # 8217 do fago λ (Lambda) são inseridos, são conhecidos como cosmídeos.

Questão 9.
Defina a enzima endonuclease de restrição.
Responder:
A enzima que corta a molécula de DNA em locais específicos é chamada de endonuclease de restrição. Essas enzimas são como tesouras moleculares, que cortam o DNA no segmento em locais específicos.

Questão 10.
Cite os géis usados ​​na técnica de eletroforese em gel.
Responder:

Questão 11.
Escreva um formulário completo de RFLP.
Responder:
O polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição é abreviado como RFLP.

RBSE Class 12 Biology Capítulo 15 - Perguntas de resposta curta

Questão 1.
O que são vetores de clonagem? Escreva um breve relato de vários vetores de clonagem usados ​​na tecnologia de rDNA recombinante?
Responder:
Após o isolamento do (s) gene (s) desejado (s), é necessário um vetor que possa incorporar esse gene e, junto com ele, entrar na célula hospedeira e replicar seu DNA nela. Este vetor é denominado vetor de clonagem. Plasmídeos, Bacteriófagos e Cosmídeos são os principais vetores de clonagem usados ​​na tecnologia de DNA recombinante.
Plasmídeos:

  • Esses são componentes extracromossômicos da célula bacteriana.
  • O DNA é uma molécula circular de fita dupla.
  • Eles contêm um local de origem de replicação e podem se replicar independentemente de um cromossomo bacteriano.
  • Eles têm locais de restrição específicos onde o gene desejado pode ser incorporado.
  • Eles têm sites marcadores.
  • O plasmídeo pode conter de 3 a mil genes.
  • Os vírus que infectam bacterianamente e causam a lise das células bacterianas são chamados de bacteriófagos.
    Exemplo: fago λ (Lambda) e M13 fago etc.
  • Os bacteriófagos são um vetor melhor em comparação com os plasmídeos.
  • Grandes segmentos de DNA (24 Kbp) podem ser clonados nos bacteriófagos.
  • Cada bacteriófago produz uma placa na cultura. Portanto, sua identificação é fácil.
  • Este é um híbrido de plasmídeo e fago λ (Lambda).
  • Estes podem se replicar na célula hospedeira como um plasmídeo.
  • Devido à presença do local & # 8216Cos & # 8217, eles são compactados como partículas de fago.
  • Os cosmídeos podem ser usados ​​para clonar o segmento de DNA de até 45 Kbp.

Questão 2.
Comentário sobre o plasmídeo PBR 322.
Responder:
O plasmídeo PBR 322 é o vetor de plasmídeo mais comumente usado. Neste plasmídeo, dois locais marcadores TetR (resistente à tetraciclina) e AmpR (resistente à ampicilina) são encontrados. Ele contém locais de reconhecimento para 12 enzimas de restrição diferentes. O DNA desejado (DNA estranho) é inserido entre os genes TetR e AmpR com a ajuda da enzima de restrição.

Questão 3.
Escreva uma breve nota sobre:

  1. Técnica de Southern Blotting.
  2. Impressão digital de DNA.
  3. Reação em cadeia da polimerase.
  4. Nomenclature of Restriction Enzymes.
  5. Características dos vetores.

Responder:
1. Técnica de Southern Blotting:
Esta técnica é usada para a análise de segmentos de DNA. Este foi desenvolvido por E.M. Southern (1975) e, portanto, denominado assim. Nesta técnica, os segmentos de DNA são transferidos em um filtro de nitrocelulose. Estes são então identificados por hibridação com as sondas de DNA.

2. Impressão digital de DNA:
Impressão digital de DNA foi descoberta por Alec Jeffreys e colegas de trabalho (1985). Neste método, o DNA de uma pessoa específica é cortado em pequenos segmentos e separado na forma de bandas por eletroforese. A identidade de uma pessoa pode ser estabelecida pela sequência de bases específica encontrada no DNA da pessoa. Esta técnica é usada para resolver disputas de paternidade de qualquer criança e para detectar doenças genéticas antes do nascimento de uma criança. Também é usado na identificação de criminosos (assassinos e estupradores, etc.)

3. Reação em cadeia da polimerase (PCR):
A reação em cadeia da polimerase foi descoberta por Mullis (1989). É uma técnica poderosa pela qual milhões de cópias de uma molécula de DNA podem ser obtidas em um tempo muito curto, sem envolver vetores para a replicação do DNA. Isso é realizado em termociclador de DNA. Repetindo este ciclo 20 & # 8211 30 vezes, lacs de cópias de DNA são obtidos.

4. Nomenclatura de enzimas de restrição:

  • O primeiro alfabeto do nome de enzima representa o nome do gênero do qual foi isolada. Está escrito em letras maiúsculas.
  • Os dois alfabetos depois disso representam as espécies do gênero. Estes são escritos em letras minúsculas.
    Nota: todas as três letras são escritas em itálico.
    Exemplo: E co = Escherichia coli.
  • O quarto alfabeto (palavra) representa a cepa da espécie da qual a enzima foi isolada.
    Exemplo Eco R = R estirpe de E. coli.
  • Se mais de uma enzima de restrição for derivada do mesmo organismo (mesma cepa), elas serão indicadas por números romanos.
    Exemplo: Eco RI, primeira enzima de restrição da cepa R de E. coli. Eco RII, segunda enzima de restrição da estirpe R de E. coli.
  • Ele pode ser inserido facilmente na célula hospedeira e pode ser isolado facilmente.
  • Deve se auto-replicar livremente na célula hospedeira.
  • O vetor deve possuir locais de restrição para que a enzima de restrição possa cortar o DNA naquele local de modo que o fragmento de DNA desejado possa ser incorporado facilmente.
  • Deve ter um gene marcador ou sítio marcador que pode ajudar na seleção de células recombinantes.
  • A transformação deve ser fácil e perfeita.
  • Para a expressão do DNA estranho desejado, o vetor deve possuir essencialmente componentes, tais como um promotor, sítios de regulação do operador.

Questão 4.
Explique o processo de formação da Biblioteca Genômica.
Responder:
A coleção do conteúdo completo de DNA de um conjunto haplóide de cromossomos (genoma) de um organismo é chamada de biblioteca genômica. Uma biblioteca genômica é formada pelo isolamento do DNA inteiro de uma célula. A biblioteca genômica é formada pelo seguinte método:

Questão 5.
Escreva uma breve nota sobre a importância do bacteriófago como vetor clonal.
Responder:
Os bacteriófagos são um vetor melhor do que os plasmídeos pelas seguintes razões:

  • Ele pode clonar segmentos de DNA de tamanho relativamente grande (24 kbp).
  • Cada bacteriófago produz uma área de placa na cultura, por meio da qual o teste é comparativamente fácil.

O fago λ (Lambda) é mais amplamente usado como um vetor do que M13 fago porque o fago λ tem DNA linear e de fita dupla e é fago de E. coli e DNA estranho de tamanho grande pode ser facilmente inserido nele & # 8217s DNA.

RBSE Class 12 Biology Capítulo 15: Perguntas do tipo dissertação

Questão 1.
Escreva sobre os diferentes estágios das técnicas da tecnologia do DNA recombinante.
Responder:
1. Identificação e isolamento do gene desejado:
O gene ou segmento de DNA desejado é identificado e para o seu isolamento é utilizada a enzima endonuclease de restrição. A enzima da endonuclease de restrição foi descoberta por Werner Arber e Hamilton O. Smith (1970).
Endonuclease de restrição:

  1. Essas enzimas são como tesouras moleculares, que cortam o DNA em locais específicos.
  2. Essas enzimas são encontradas naturalmente em bactérias como E.coli, Bacillus, Streptococcus e Thermus aquáticos.
  3. As enzimas de endonuclease de restrição são de três tipos:
    1. Endonuclease Tipo I (RI)
    2. Endonuclease Tipo II (R-II)
    3. Endonuclease Tipo III (RIII). Tipo II.

    Nota: A endonuclease de restrição (RII) é mais comumente usada na clonagem de genes e mapeamento de restrição.
    Exemplo: E.co.RI, Hind II etc.

    Nomenclatura de endonuclease de restrição:

    1. O primeiro alfabeto do nome da enzima representa o gênero do qual foi isolada. Isso sempre é escrito em maiúsculas.
    2. Os dois alfabetos depois disso representam as espécies desse gênero. Estes são escritos em letras minúsculas.
      Nota: todas as três letras são escritas em itálico
      Exemplo: Eco de Escherichia coli.
      Hin & # 8211 De Haemophilus influenza.
    3. A quarta palavra representa a cepa do gênero do qual a enzima foi isolada.
      Exemplo: Eco R & # 8211 da cepa R de E. coli.
    4. No caso de mais de uma enzima de restrição ser obtida de um organismo, seu número é indicado por números romanos.
      Exemplo: Eco RI, (primeiro da cepa R de E. coli) Eco RII etc. (Segundo da cepa R. de E. coli) A enzima da endonuclease Eco RI reconhece a sequência de base específica na molécula de DNA e corta entre a base G e A.

    Nota: Quando segmentos de DNA obtidos de duas fontes diferentes são misturados na presença da enzima DNA ligase, ambos os segmentos de DNA são unidos por ligações fosfo-di-éster e formam uma estrutura de fita dupla.

    Outras enzimas usadas em Engenharia Genética:

    1. Polimerase de DNA dependente de RNA & # 8211 Esta enzima provoca a polimerização de nucleotídeos da fita de DNA em um modelo de RNA.
    2. DNA polimerase dependente de DNA & # 8211 Esta enzima provoca a polimerização de nucleotídeos da fita complementar de DNA em um molde de DNA.
    3. Ligase & # 8211 Esta enzima une as extremidades dos segmentos de DNA no modelo.
    4. Lisozimas & # 8211 Essas enzimas dissolvem a parede celular das bactérias para que o DNA bacteriano possa ser facilmente isolado.
    5. Fosfatases alcalinas & # 8211 Esta enzima corta o fosfato na extremidade 5 & # 8242 do DNA circular e ajuda a mantê-lo em uma forma linear para que o segmento de DNA estranho possa ser inserido nele. Esta enzima impede a natureza circular do DNA.

    2. Seleção de vetores de clonagem:
    O gene desejado é isolado com a endonuclease de restrição. Este gene desejado contendo um segmento de DNA é então incorporado em um vetor adequado. Este vetor deve ser capaz de entrar no hospedeiro alvo ou célula receptora e deve replicar seu DNA na célula hospedeira.

    Recursos essenciais do Vector:

    1. Ele pode ser inserido facilmente na célula hospedeira e pode ser isolado facilmente.
    2. Deve replicar-se livremente na célula hospedeira.
    3. O vetor deve possuir locais de restrição específicos para que a enzima de restrição possa cortar o DNA nesses locais e o fragmento de DNA desejado possa ser incorporado facilmente.
    4. Deve ter um gene marcador ou sítio marcador que pode ajudar na seleção de células recombinantes.
    5. A transformação por ele deve ser fácil e perfeita.
    6. Para a expressão do DNA estranho desejado, o vetor deve possuir essencialmente componentes, tais como um promotor, sítios de regulação do operador.

    Nota: Em E. coli, tanto os vetores naturais quanto os artificiais podem ser usados.

    Alguns vetores importantes usados ​​em E. coli são:

    1. Plasmídeo:
    Lederber, (1952) observou pela primeira vez os plasmídeos como material extracromossômico em células bacterianas. Possui os seguintes recursos importantes.

      1. Estes são componentes extracromossômicos (exceto DNA cromossômico).
      2. Estas são moléculas circulares de DNA de fita dupla
      3. Eles contêm uma origem de replicação (ori). Portanto, ser capaz de se replicar de forma independente dentro da célula.
        1. Eles não são necessários para o crescimento e sobrevivência das bactérias
          .
        1. Estes contêm locais de restrição específicos onde o gene desejado pode ser inserido.
        2. Genes marcadores ou sítios marcadores também são encontrados.
        3. O plasmídeo pode conter de três a mil genes.

        Nota: O vetor plasmídeo mais comumente usado é o pBR322.
        Neste plasmídeo, dois locais marcadores TetR (resistente à tetraciclina) e AmpR (resistente à ampicilina) são encontrados. Ele contém locais de reconhecimento para 12 enzimas de restrição diferentes. O DNA desejado (DNA estranho) é inserido entre os genes TetR e AmpR com a ajuda da enzima de restrição.

        Para inserir o DNA estranho no plasmídeo, ele é tornado linear pelo uso da enzima de restrição e, em seguida, entre as duas extremidades do DNA do plasmídeo, DNA estranho de 5-10 Kb é inserido ou incorporado.

        Nota: Dependendo da condição de replicação, o material cromossômico extra encontrado na célula bacteriana é chamado de plasmídeo ou epissoma. A estrutura extracromossômica capaz de se replicar independentemente é chamada de plasmídeo, mas se ela se replica apenas quando unida ao cromossomo bacteriano junto com ele, é chamada de epissoma.

        2. Bacteriófago:
        Os vírus que infectam as bactérias são chamados de bacteriófagos.
        Exemplo: λ (Lambda) e M13 etc.
        Os bacteriófagos são um vetor melhor do que os plasmídeos pelas seguintes razões:

        • O fragmento de DNA de grande tamanho (24Kb) pode ser clonado nestes.
        • Cada bacteriófago produz uma área de placa através da qual o teste é comparativamente fácil.

        O fago λ é mais amplamente utilizado como vetor do que M13 por causa do seguinte:

        • Eles são bacteriófagos de E.coli.
        • O DNA é linear e de fita dupla.
        • Parte não essencial de um DNA de fago pode ser removida. Como resultado, o tamanho da molécula do vetor é reduzido, portanto, DNA estranho de grande porte pode ser facilmente inserido nela.

        • É um híbrido de plasmídeo e fago lambda (λ).
        • Foi construído primeiro por Barbara Horn e John Collins (1978).
        • Esses plasmídeos, nos quais as sequências de DNA do local & # 8216Cos & # 8217 do DNA do fago lambda são inseridas, são conhecidos como cosmídeos. Portanto, o cosmídeo possui as características tanto do plasmídeo quanto do bacteriófago lambda.
        • Os cosmídeos se replicam na célula bacteriana exatamente como o plasmídeo e, devido à presença do local & # 8216Cos & # 8217, eles são compactados como partículas de fago lambda.
        • Os cosmídeos podem ser usados ​​para clonar segmentos de DNA de até 45 Kbp de tamanho.
          Exemplo: cosmídeo PLFR-5
        • Neste cosmídeo estão presentes dois sítios Cos, 6 sítios de endonuclease de restrição, o sítio de origem de replicação e genes de resistência a antibióticos de tetraciclina.

        Nota: Além do plasmídeo, bacteriófagos e cosmídeo, existem alguns outros vetores também sendo usados ​​na engenharia genética.

        Os transposons também são conhecidos como genes Jumping.

        3. Inserção do gene desejado no vetor de clonagem:
        Para a inserção do gene desejado em um vetor de clonagem, primeiro são feitas regiões de restrição semelhantes em ambos os genes. Depois disso, os dois são unidos (já que ambos têm os mesmos locais de restrição). Este processo é denominado Ligadura.
        Neste processo são necessárias as seguintes enzimas:

        1. Endonucleases de restrição
        2. Metilases
        3. DNA ligases
        4. Fosfatases alcalinas
        5. Transcriptase reversa
        6. Transferases terminais

        4. Multiplicação de DNA recombinante na célula hospedeira:
        O DNA recombinante pode ser inserido na célula hospedeira seguindo dois métodos:

        Nesse processo, a célula bacteriana de E. coli é usada principalmente como hospedeira. Esses processos (Transformação e Transdução) foram estudados anteriormente. O DNA recombinante se multiplica nas células de E. coli

        5. Identificação do gene clonado e sua transferência em outros organismos:

        • Estamos usando certos genes, como o gene resistente a antibióticos ou o gene LacZ (que produz β galactosidase) como genes marcadores, de modo que se locais de clonagem estiverem presentes nesses genes e o DNA for inserido entre eles, os genes se tornam não funcionais e chamados de insercionais inativação.
        • Com base na expressão ou não expressão de um determinado gene como um gene marcador, podemos selecionar recombinantes de não recombinantes.
        • Além dos genes marcadores, existem alguns outros genes que produzem características específicas. Eles são chamados de genes repórter, que parecem totalmente diferentes de outras células devido a características especiais.
          Exemplo: gene LUC (Luciferase) que é encontrado no vaga-lume e produz Bioluminescência.

        Questão 2.
        Descreva as diferentes técnicas de blotting em detalhes.
        Responder:
        Técnica de Blotting:
        Nesta técnica, segmentos de DNA são derivados em gel de agarose por eletroforese e, em seguida, são transferidos e estabilizados em um filtro de nitrocelulose. Estes são então identificados por hibridação com sondas de DNA. Esse processo é chamado de técnica de blotting.
        1. Técnica de Southern Blotting: E.M. Southern (1975) usou este método pela primeira vez e transferiu segmentos de DNA no filtro de nitrocelulose. Esta técnica foi denominada técnica de Southern blotting. Por meio dessa análise técnica do DNA, os segmentos são feitos.

        2. Técnica de Northern Blotting:
        Alwin et al (1979) transferiram segmentos de RNA após eletroforese em membrana de oximetria de aminobenzil (OBM) no lugar de filtro de nitrocelulose. Esta técnica foi denominada técnica de Northern blotting. Esta técnica é usada para a análise de segmentos de RNA.

        3. Técnica de Western Blotting:
        Tobin et al. (1979) primeiro decompõe proteínas em polipeptídeos com a ajuda de sulfato de sódio-do-decil (SDS). Após separá-los com o auxílio da eletroforese, transferi-los em filtro de nitrocelulose ou membrana de náilon. These were then decoded on an X-ray plate and identified the protein. By this technical analysis of proteins is done. This is called western blotting technique.

        Questão 3.
        Write a detailed account on plasmid as a cloning vector.
        Responder:
        Plasmid:
        Lederber, (1952) first observed the plasmids as extrachromosomal material in Bacterial cell. It has the following important features.

        • These are extrachromosomal. (Other than chromosomal DNA) components.
        • These are circular, double-stranded DNA molecules.
        • They contain an origin of replication (ori). Hence being able to replicate independently within the cell.
        • These are not necessary for the growth and survival of Bacteria.
        • These contain specific restriction sites where the desired gene can be inserted.
        • Marker genes or marker sites are also found.
        • The plasmid may contain three to one thousand genes.

        Most commonly used plasmid vector is pBR322.
        In this plasmid, two marker sites TetR (Tetracycline resistant) and AmpR (Ampicillin resistant) are found. It contains recognition sites for 12 different restriction enzymes. Desired DNA (foreign DNA) is inserted in between TetR and AmpR gene with the help of restriction enzyme.

        Questão 4.
        What do you understand by molecular probes? Explain its utility.
        Responder:
        Molecular Probes:
        Segments of DNA or RNA with the help of which cDNA or RNA segments of any organism present in it can be identified are called molecular probes.
        The molecular probes are of two types.

        • These are used to identify specific DNA segments used in the research of genetic engineering.
        • Pollutants in food can be detected with the help of probes.
        • These are used in the field of forensic science, in resolving disputed paternity issues and establishing the family relationship.
        • These can be used to identify an improved variety of crops and hybridized seeds of crops.

        Questão 5.
        Write an essay on the importance of genetic engineering.
        Responder:
        Scientist working in the field of biotechnology have succeeded in achieving results which have proved advantageous in the field of medical science, agriculture and industries. By using these techniques it has become possible to improve the variety of agricultural crops and domestic animals and also the quality of industrial products. Presently biotechnology is considered as the most important branch of biology.
        Some important achievements are as follows:


        Plasmid vs Lentivirus as a transfection vector - Opinions? (Jan/12/2008 )

        I'm looking into creating a stably transfected variant of a few human tumor cell line that I'll eventually use for xenograft experiments. I'd like to insert a tag for in vivo imaging (IVIS). I'm thinking GFP or luciferase would be suitable, but I'm not sure what is a better vector. I have a pEGFP plasmid left over from a earlier student in the lab that I could use with lipofectamine, but someone suggested a lentiviral GFP would be better. My specific questions are:

        Would I expect a difference in transfection stability, assuming G418 selection?
        After selecting G418-resistant clones, can I remove the G418 before xenograft?
        Would one or the other have a greater trasfection efficiency?

        Any opinion would be appreciated! Cheers-JAH

        lentivirus are good for cells that are hard to trasnfect using lipids. the choice of reporter system depends on which imagine system do you have. Luc is better and more quatitative.

        For your specific questions:
        1) stability is more or less gene specific. ie. is the gene you want to express grwoth promoting or inhibitory. Cells will drop the inhibitory gene over time if you dont use a regulated expression system. Both routes can generate stable cell lines.

        2) Yes, you can remove selection pressure for a few generations.

        3) Its cell type dependent. Lenti have more chance to work but making virus is more exprensive and takes longer to get the virus.

        Would I expect a difference in transfection stability, assuming G418 selection?
        i don't strickly remember the mechanism of virus insertion in genomic dna but i still belive that the DNA is circular or should be opened for linear insertion. In viruses, the opening point is quite strict, and does not interferes either with your selection gene or the gene of interest. So it's better than plasmids in this way, as the opening point wich is not compatible with the selectio marker may occur in the gene of interest.

        After selecting G418-resistant clones, can I remove the G418 before xenograft?
        yes you can remove it but for few generations as mentioned previously.

        Would one or the other have a greater trasfection efficiency?
        it depends on the cell type. for hela 293 and such cells, transfection by plasmids gets a high efficiency. On primary cell lines, transfection has a poor efficiency and lentiviruses have better delivery efficiency in general. so retroviruses are better choice (if you can afford costs)

        My preference would be to go with plasmid transfection than lentiviral infection as virus preps are more time consuming and an additional step. Also to choose between GFP and luciferase, it depends on the experiments you wish to do. if you wish to use them for invivo, then having gfp will help in easy readout. But something quantititaive, then luc might be better.

        In terms of stability, both methods should be kind of similar.

        One can get high transfection efficiency with both systems, ofcourse depending on cell types. but something like 293 or hela, it should be fine.

        Thanks again for all of your comments. I think for my purposes, I don't necessarily need quantitative data, so I think GFP will be sufficient. Basically, I'm orthotopically inoculating human rhabdomyosarcoma cells into the thigh muscle of nude mice and would like to be able to verify tumor engraftment after injection and localize metastases, should they occur I'd also like to perform FFPE histology with the affected tissues, so I think GFP will facilitate this better than a luciferase tag. I've not tried to transfect anything into these cells so I don't know yet if thay are as genehunter-1 put it "hard to trasnfect using lipids". Reading these responses, I'm inclined to try the plasmid vector first As such a few more questions came to mind.

        "Yes, you can remove selection pressure for a few generations." (genehunter-1, regarding G418 selection)
        "yes you can remove it but for few generations as mentioned previously." (fred_33, regarding G-418 selection)

        1) I can't very well put G418 in to mice though. should I just wean the selected cells off of the G418 prior to inoculation, and just hope they don't kick out the plasmid?

        Quoth fred_33:"i still belive that the DNA is circular or should be opened for linear insertion. So it's better than plasmids in this way, as the opening point which is not compatible with the selection marker may occur in the gene of interest."
        1) So, should I compare a linearized plasmid in parallel with a circular/supercoiled one?
        2) Assuming the plasmid is linearized by RE digestion, is there a particular end (blunt/sticky/overhang) that I should strive for?
        3) Where should the digestion site be. obviously not through the GFP or selection gene or their promoter/regulatory regions so as not to alter the ORF?

        Quoth genehunter-1 "is the gene you want to express grwoth promoting or inhibitory. Cells will drop the inhibitory gene over time if you dont use a regulated expression system. & quot
        - I don't believe the plasmid I have is explicitly responsive to growth regulatory process. I believe the promoter was cloned from a 'housekeeping' gene, though I'm trying to figure out what this regulatory element is. Anyway, the cells I'm going to try are show very aggressive growth, doubling in

        18h, and do not appear to be contact inhibited at all. But I'm not sure if the plasmid harbors something that might change this behavior, but will be sure to compare them vs. non-transfected cells before in-vivo use.


        A plasmid is an extrachromosomal DNA of bacteria, yeasts, archaea and protozoa. They are small double-stranded circular DNA molecules. Whereas, a vector is a small DNA molecule that acts as a vehicle to deliver foreign DNA from donor to host. So, this is the key difference between plasmid and vector.

        Moreover, a further difference between plasmid and vector is that the plasmids are naturally occurring in bacteria and other organisms, but some vectors are natural while some are artificially synthesized.

        Below infographic summarizes the difference between plasmid and vector.


        The Next Plasmid

        Interestingly, the biologists who do not think they need design tools are often craving better tools for supporting their laboratory efforts. Tools for primer design, for planning of cloning experiments, and for sample tracking are very high on their wish list. This may partly explain their lack of interest in the design aspect of their work.

        The vast majority of potential users of design tools have been trained to clone DNA. They are completely focused on the process of deriving new DNA molecules from existing ones.

        When they say that their project is simple, they don't mean that it will be simple to deliver an expression system that works. What they mean is that it is simple to figure out the next plasmid to make.

        For instance, if it is easy to add a solubility tag to the coding sequence of a gene in an existing plasmid, then they assume there is nothing more to think about. The next plasmid to make is easily identified mostly based on the ease of cloning criteria, not on functional criteria.


        Discussion Questions

        1. Why was it important to find an enzyme that would cut the plasmid at only one site? What could happen if the plasmid were cut at more than one site?

        2. Which restriction enzyme did you use? _____________ Ask other groups what they used and compare the final transgenic plasmids. Why might there be some of different lengths?


        3. Why was it important to discard any enzymes that cut the plasmid at the replication site?

        4. Why is it important to cut the plasmid and the human DNA with the same restriction enzyme?

        5. Do restriction enzymes exist naturally in organisms? If so, what is their purpose?

        6. Why would restriction enzymes that created "blunt" ends not be as useful in recombination as those that create sticky ends?


        7. In the activity, you simulated creating a recombinant bacteria organism. For each of the following materials, indicate what they represent?

        Scissors _______________________________________Tape ______________________________________



        Assista o vídeo: Wybór Gracie Gracies Choice 2004 polski dubbing (Junho 2022).


Comentários:

  1. Aundre

    Na minha opinião isso é óbvio. Eu encontrei a resposta para sua pergunta no google.com

  2. Basho

    you express it perfectly

  3. Huxeford

    Esta situação é familiar para mim. Pronto para ajudar.

  4. Zulema

    Obrigada pelo esclarecimento. Tudo engenhoso é simples.



Escreve uma mensagem