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9.12: Fazendo DNAs recombinantes - Biologia

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Os biólogos moleculares geralmente criam DNAs recombinantes unindo fragmentos de DNA de diferentes fontes. Plasmídeos usados ​​em métodos de DNA recombinante

  1. replicar em grande número na célula hospedeira;
  2. carregam marcadores que permitem aos pesquisadores identificar as células que os carregam (resistência a antibióticos, por exemplo) e
  3. contêm sequências (como um promotor e sequência Shine Dalgarno) necessárias para a expressão da proteína desejada na célula alvo. Um plasmídeo que possui todas essas características é referido como um vetor de expressão (veja um exemplo na figura à esquerda).

Os plasmídeos podem ser extraídos do hospedeiro, e qualquer gene de interesse pode ser inserido neles, antes de devolvê-los à célula hospedeira. A produção de tais plasmídeos recombinantes é um processo relativamente simples. Envolve

  1. corte do gene de interesse com uma enzima de restrição (endonucleases que cortam sequências de DNA específicas);
  2. corte do DNA do plasmídeo de expressão com enzima de restrição, para gerar extremidades compatíveis com as extremidades do gene de interesse;
  3. unir o gene de interesse ao DNA de plasmídeo usando DNA ligase;
  4. introdução da plasmit recombinante em uma célula bacteriana; e
  5. células em crescimento que contêm o plasmídeo. As células bacterianas portadoras do plasmídeo recombinante podem então ser induzidas a expressar o gene inserido e produzir grandes quantidades da proteína por ele codificada.

7 estágios principais da tecnologia de DNA recombinante

Os pontos a seguir destacam os sete estágios principais da tecnologia do DNA recombinante. As etapas são: 1. Isolamento do Material Genético (DNA) 2. Corte de DNA em locais específicos 3. Isolamento de fragmento de DNA desejado 4. Amplificação do gene de interesse usando PCR 5. Ligação do fragmento de DNA em um vetor 6. Inserção de DNA recombinante na célula / organismos hospedeiros 7. Obtenção ou cultivo do produto de gene estrangeiro.

Estágio 1. Isolamento do Material Genético (DNA):

O ácido nucléico é o material genético presente em todos os organismos vivos. Na maioria dos organismos, está presente na forma de ácido desoxirribonucléico (DNA). O DNA deve estar presente na forma pura, isto é, livre de outras macromoléculas (como proteínas, RNA, enzimas, etc.) para cortar o DNA com enzimas restritivas.

O isolamento do material genético (DNA) é realizado nas seguintes etapas:

(a) Uma vez que o DNA está encerrado dentro das membranas, então, para liberar DNA junto com outras macromoléculas, como proteínas, polissacarídeos e lipídios, células bacterianas / vegetais ou tecidos animais são tratados com a enzima lisozima (bactérias), celulose (células vegetais), quitinase (fungo), respectivamente.

(b) O RNA pode ser removido pelo tratamento com ribonuclease, enquanto as proteínas podem ser removidas pelo tratamento com protease.

(c) Outras moléculas podem ser removidas por tratamentos apropriados e, por fim, o DNA purificado precipitará, após a adição de etanol resfriado. Isso pode ser visto como uma coleção de fios finos na suspensão.

Etapa 2. Corte de DNA em locais específicos:

As digestões com enzimas de restrição são realizadas incubando moléculas de DNA purificadas com a enzima de restrição. Isso é feito nas condições ideais para essa enzima específica.

Etapa # 3. Isolamento de fragmento de DNA desejado:

Usando eletroforese em gel de agarose, a atividade das enzimas de restrição pode ser verificada. Uma vez que o DNA é carregado negativamente, ele se move em direção ao eletrodo ou ânodo positivo e o DNA tende a se separar neste processo. Depois disso, o fragmento de DNA desejado é eluído.

Etapa 4. Amplificação do gene de interesse usando PCR:

A reação em cadeia da polimerase (PCR) é melhor definida como a replicação do DNA in vitro. Esta técnica foi desenvolvida por Kary Mullis em 1985 e recebeu o Prêmio Nobel de Química em 1993. O PCR é usado para a amplificação do gene de interesse usando dois conjuntos de primers.

Os requisitos básicos de uma reação de PCR são os seguintes:

O DNA de fita dupla que precisava ser amplificado.

Estes são oligonucleotídeos sintetizados quimicamente (segmento curto de DNA) que são complementares a uma região do molde de DNA.

Duas enzimas são comumente usadas.

É isolado de uma bactéria termofílica, isto é, Thermus aquaticus. Ele tem a propriedade de permanecer ativo durante a alta temperatura que induziu a desnaturação do DNA de fita dupla.

ii. Também auxilia na amplificação de um segmento de DNA em aproximadamente bilhões de vezes, ou seja, 1 bilhão de cópias são feitas se o processo de replicação do DNA for repetido muitas vezes.

iii. Vent Polymerase (isolada de Thermococcus litoralis).

Três etapas principais envolvidas na técnica de PCR são:

O DNA de fita dupla é desnaturado usando alta temperatura de 95 ° C por 15 segundos. Agora, cada fita simples separada atua como um modelo para a síntese de DNA.

Dois conjuntos de iniciadores oligonucleotídicos são usados ​​para anelar (hibridar). Esta etapa é realizada a uma temperatura ligeiramente inferior (40-60 ° C) usando Mg 2+ e dNTPs (trifosfatos de desoxinucleosídeo), dependendo do comprimento e da sequência dos iniciadores.

A enzima termoestável Taq DNA polimerase é usada nesta reação, que pode tolerar a alta temperatura da reação que estende os primers pela adição de nucleotídeos complementares ao molde.

O Mg 2+ é necessário como um cofator para a polimerase de DNA termoestável, por exemplo, polimerase Taq.

Essas etapas são repetidas várias vezes para obter várias cópias do DNA desejado.

Etapa 5. Ligação do fragmento de DNA em um vetor:

Este processo requer um DNA vetor e um DNA fonte. Para obter pontas pegajosas, ambos devem cortar com a mesma endonuclease. Após o que ambos são ligados misturando o DNA do vetor, o gene de interesse e a enzima DNA ligase para formar o DNA recombinante / DNA híbrido.

Etapa # 6. Inserção de DNA recombinante na célula / organismos hospedeiros:

Isso pode ocorrer por vários métodos, antes dos quais as células receptoras se tornam competentes para receber o DNA. Se um gene contendo DNA recombinante para resistência a um antibiótico (por exemplo, ampicilina) é transferido para células de E. coli, as células hospedeiras se transformam em células resistentes à ampicilina.

O gene de resistência à ampicilina, neste caso, é denominado marcador selecionável. Quando as células transformadas são cultivadas em placas de ágar contendo ampicilina, apenas os transformantes crescerão e outros morrerão.

Estágio # 7. Obtenção ou cultivo do produto de gene estrangeiro:

Quando você insere um pedaço de DNA alienígena em um vetor de clonagem e o transfere para uma célula bacteriana, o DNA alienígena se multiplica. O objetivo final é produzir uma expressão de proteína desejável. As expressões do gene ou genes estranhos nas células hospedeiras envolvem a compreensão de muitos detalhes técnicos.

Se o gene codificado pela proteína é expresso no hospedeiro heterólogo, é denominado proteína recombinante. As células que abrigam genes clonados de interesse são cultivadas em pequena escala no laboratório. Estas culturas de células são usadas para extrair a proteína desejada usando várias técnicas de separação.


Tecnologia de DNA recombinante | Genética

A tecnologia do DNA recombinante revolucionou as ciências da vida, abrindo novas perspectivas para a pesquisa em biologia molecular. Permite a manipulação genética por meio de técnicas de síntese, amplificação e purificação de genes individuais de qualquer tipo de célula.

A genômica surgiu como uma extensão da tecnologia de DNA recombinante para mapeamento e caracterização de alta resolução de genomas inteiros e produtos gênicos em grande escala, conhecida como análise global.

Essas disciplinas que avançam rapidamente prometem novos insights sobre dados de sequência, organização, expressão e regulação do material genético. A engenharia genética é uma consequência natural dessas técnicas, explorando a aplicação na indústria médica, biotecnológica e nos campos agrícolas.

O sucesso da tecnologia de DNA recombinante é baseado em algumas descobertas importantes: enzimas de restrição que podem cortar e unir fragmentos de DNA (tesouras moleculares) para manipulações em um tubo de ensaio, uso de plasmídeos e DNA de bacteriófago como vetores (veículos) para DNA estranho que pode se replicar em cópias idênticas e produzem clones contendo DNA recombinante, introdução da técnica de Southern blotting e desenvolvimento da reação em cadeia da polimerase para amplificação de uma sequência específica.

As moléculas de DNA recombinante podem ser purificadas e investigadas para a compreensão da estrutura e sequência do gene, e podem ser inseridas em outro genoma.

As moléculas de DNA recombinante são construídas artificialmente, incorporando DNA de duas fontes diferentes em uma única molécula recombinante. O processo é diferente da recombinação, que é um processo natural em organismos que se reproduzem sexualmente, em que um único indivíduo obtém uma combinação de genes de dois organismos parentais.

A recombinação natural envolve a união de sequências de nucleotídeos semelhantes no DNA cromossômico, quebra e troca de segmentos correspondentes e reintegração. Esse tipo de recombinação, notavelmente, produz novos arranjos de alelos e geralmente ocorre em espécies intimamente relacionadas. Não ocorre em organismos não relacionados devido a barreiras naturais.

Endonucleases de restrição:

As endonucleases de restrição são uma classe de enzimas que podem reconhecer e se ligar a sequências de DNA específicas de quatro a oito nucleotídeos e, em seguida, clivar a estrutura de açúcar-fosfato de cada uma das duas fitas no local de ligação. Todas as enzimas de restrição cortam o DNA entre o carbono 3 & # 8242 e a porção fosfato da estrutura fosfodiéster.

Portanto, os fragmentos produzidos pela digestão com enzimas de restrição têm 5 & # 8242 fosfatos e 3 & # 8242 hidroxilas. A maioria das enzimas de restrição está presente em bactérias, apenas uma foi encontrada na alga verde Chlorella. Nas bactérias, as enzimas de restrição protegem a bactéria contra DNA estranho, como o dos vírus, cortando o DNA viral invasor. Assim, eles restringem a entrada de DNA estranho na célula bacteriana.

A bactéria modifica seus próprios locais de restrição por metilação, de modo que seu próprio DNA fica protegido da enzima de restrição que ela produz. Três cientistas que descobriram as enzimas de restrição e suas aplicações, a saber, Adams, Nathan e Smith, receberam o Prêmio Nobel em 1978.

Mais de 400 enzimas de restrição diferentes foram isoladas. A enzima de restrição EcoRI (de E. coli) reconhece a seguinte sequência de seis pares de bases de nucleotídeos no DNA de qualquer organismo: 5 & # 8242-GAATTC-3 & # 8242 e 3 & # 8242-CTTAAG-5 & # 8242.

Esse tipo de sequência de nucleotídeos é considerado simétrico, denominado palíndromo porque ambas as fitas têm a mesma sequência de nucleotídeos na orientação antiparalela. Várias enzimas de restrição diferentes reconhecem palíndromos específicos. Muitas enzimas de restrição incluindo EcoRI cortam a sequência produzindo extremidades escalonadas. EcoRI corta entre G e A (Fig. 23.1).

Os cortes escalonados dão origem a um par de cinco nucleotídeos idênticos de cadeia única longa & # 8220 extremidades pegajosas & # 8221. As extremidades consistem em uma peça saliente de DNA de fita simples que é considerada pegajosa porque pode emparelhar por ligação de hidrogênio a uma sequência complementar. As extremidades pegajosas produzidas por enzimas de restrição são desejáveis ​​na tecnologia de DNA recombinante.

Se duas moléculas de DNA diferentes são cortadas com a mesma enzima de restrição, os fragmentos de cada uma terão as mesmas extremidades pegajosas que são complementares, permitindo que se hibridem entre si em condições apropriadas. Algumas enzimas de restrição, como pequenas, cortam a sequência alvo no meio, produzindo extremidades cegas que não possuem extremidades pegajosas.

Eles também podem ser usados ​​para fazer moléculas de DNA recombinante com a ajuda de enzimas que unem as pontas cegas ou outras enzimas especiais que sintetizam pontas pegajosas de fita simples curtas na fita 3 & # 8242 exposta da ponta cega.

A digestão do DNA por uma enzima de restrição produz fragmentos de diferentes comprimentos. Por exemplo, o DNA do bacteriófago λ cortado com a enzima de restrição EcoRI produz seis fragmentos que variam em tamanho de 3,6 a 21,2 quilo bases de comprimento (um quilo base ou kb = 1.000 pares de bases). Esses fragmentos podem ser separados de acordo com o tamanho por eletroforese em gel (Figs. 23.2, 3) ou por outros métodos.

Os fragmentos juntos fornecem um mapa dos locais EcoRI no DNA do fago λ. Se várias endonucleases de restrição diferentes forem usadas, as localizações de seus locais de clivagem podem ser usadas para gerar mapas de restrição detalhados da molécula de DNA.

Eletroforese em gel para separação de fragmentos de DNA:

As células são homogeneizadas e os núcleos isolados para extração de DNA. Para lisar núcleos e liberar DNA, um detergente carregado negativamente dodecilsulfato de sódio (SDS) é usado. A próxima etapa envolve a purificação do DNA de contaminantes como RNA e proteínas. Para remover as proteínas, a mistura é agitada com fenol ou clorofórmio.

O fenol torna as proteínas insolúveis e as precipita para fora da solução. Como o fenol e a solução salina tamponada são imiscíveis, eles formam duas fases separadas. A centrifugação dá DNA ou RNA na fase aquosa superior, enquanto o precipitado de proteína forma a fronteira entre as duas fases.

A fase aquosa contendo o ácido nucleico é removida do tubo e agitada com fenol, seguido de centrifugação. O processo é repetido até que nenhuma outra proteína possa ser removida da solução. O etanol frio é então colocado em camadas sobre a solução aquosa de DNA, e o DNA é retirado com um bastão de vidro na interface entre o etanol e a solução salina. O RNA forma um precipitado que se deposita no fundo do vaso.

Para tornar a preparação de DNA livre de RNA, o DNA é tratado com ribonuclease. A ribonuclease é destruída pelo tratamento com protease, e a protease é removida pelo uso de fenol. O DNA purificado é então precipitado novamente com etanol.

A eletroforese depende da capacidade das moléculas carregadas de migrar em um campo elétrico. Os pequenos fragmentos de DNA de algumas centenas de nucleotídeos ou menos, produzidos por uma endonuclease de restrição, podem ser separados por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE). Os fragmentos de DNA maiores que variam em tamanho de algumas centenas de pares de bases a cerca de 20 kb podem ser separados em géis de agarose.

O mecanismo de separação de fragmentos de DNA envolve a migração de moléculas de DNA através dos poros do gel matricial. A agarose consiste em uma rede complexa de moléculas polimerizadas, cujo tamanho de poro é determinado pela composição do tampão e pela concentração de ágar usado.

A visualização por microscopia de fluorescência revelou que, durante a eletroforese, as moléculas de DNA se alongam na direção do campo aplicado e se contraem em bolas densas. O tamanho da bola de DNA deve ser menor do que o tamanho dos poros no gel para passar. Se o volume da bola de DNA exceder o tamanho dos poros do gel, a molécula de DNA só poderá passar por um movimento serpentino semelhante ao de uma cobra.

Moléculas de DNA de até 20 kb podem migrar através dos poros do gel por este mecanismo. Estudos demonstraram que tanto o comprimento do fragmento quanto o peso molecular determinam a taxa de migração das moléculas de DNA em um gel. Para a determinação precisa do tamanho de uma molécula de DNA, amostras de DNA marcador de tamanho conhecido são submetidas à eletroforese no mesmo gel.

O procedimento para eletroforese em gel de poliacrilamida é o seguinte. Uma mistura de fragmentos lineares de DNA de diferentes tamanhos é impulsionada pela corrente através do gel composto por moléculas orgânicas de acrilamida. A reticulação das moléculas de acrilamida forma uma peneira molecular em uma placa fina de gel de poliacrilamida entre duas placas de vidro. A placa de gel é suspensa entre dois compartimentos contendo tampão no qual os eletrodos positivo e negativo são imersos (Fig. 23.2).

A amostra contendo moléculas lineares de DNA (fragmentos) é colocada em poços ao longo do topo do gel, próximo ao cátodo do campo elétrico. A tensão aplicada entre os compartimentos do buffer permite que a corrente flua pela laje. Por causa de seus grupos fosfato carregados negativamente, o DNA migra em direção ao eletrodo positivo (ânodo) em velocidades inversamente dependentes de seu tamanho. Ou seja, os fragmentos menores migram mais rapidamente.

Todas as moléculas de DNA, independentemente do seu comprimento, possuem densidade de carga semelhante, ou seja, o número de cargas negativas por unidade de massa e, portanto, todas possuem potencial equivalente de migração no campo elétrico. Quanto maior a massa molecular do fragmento de DNA, mais lentamente ele se move pelo gel. Portanto, quanto menor o fragmento, mais longe ele migra no gel.

Portanto, se houver classes de tamanho distintas na mistura de fragmentos de DNA, essas classes formarão bandas distintas no gel. Os fragmentos de tamanhos diferentes são separados uns dos outros (Fig. 23.3). As bandas podem ser visualizadas pela coloração do DNA com brometo de etídio.

A migração dos fragmentos de DNA pode ser comparada com um conjunto de padrões de tamanho de controle que foram carregados no mesmo gel, para determinar o tamanho exato de cada fragmento na mistura. Além disso, se as bandas estiverem bem separadas, uma única banda pode ser cortada do gel e a amostra de DNA pode ser extraída e purificada.

Fragmentos maiores de DNA, que não passam pelos poros da poliacrilamida, são fracionados em géis de agarose que apresentam maior porosidade. A agarose é um polissacarídeo de algas marinhas, é dissolvido em tampão quente e despejado no molde e um pente colocado na agarose fundida. Abaixar a temperatura solidifica a agarose como um gel. O pente é removido produzindo poços no gel. As amostras de DNA são carregadas nos poços.

Géis com 0,3% de concentração de agarose são usados ​​para separar fragmentos de DNA maiores. Depois de correr o gel, os fragmentos de DNA podem ser identificados usando uma sonda marcada, para um fragmento específico. Alternativamente, o gel pode ser corado com uma solução de brometo de etídio que intercala nas bases da dupla hélice. As bandas de DNA podem ser visualizadas sob luz ultravioleta usando um transiluminador.

Eletroforese em gel de campo de pulso:

A separação de moléculas de DNA maiores que 20 kb, até 10 Mb pode ser realizada pelo uso de eletroforese em gel de campo de pulso (PFGE). No PFGE, a orientação do campo elétrico em relação ao gel é alterada de maneira regular, o que faz com que o DNA altere periodicamente sua direção de migração no gel.

Cada vez que há uma mudança na orientação do campo elétrico, o eixo do DNA deve se realinhar antes de iniciar a migração na nova direção. A diferença entre a direção da migração do DNA induzida por campos elétricos sucessivos determina o ângulo através do qual o DNA deve girar para mudar sua direção de migração. Para fazer a amostra funcionar em linhas retas, foram desenvolvidos métodos aprimorados para alternar o campo elétrico. O PFGE é amplamente utilizado em laboratórios de biologia molecular.

Southern Blotting:

Quando o DNA genômico é submetido à digestão por enzimas de restrição, resulta em um grande número de fragmentos. Um gel corado contendo vários fragmentos separados por eletroforese mostra uma mancha contínua de DNA em vez de bandas distintas. A técnica de Southern blotting desenvolvida por E. M. Southern permite que um único fragmento de DNA ou um gene específico seja identificado nesta mistura.

Esta é uma técnica amplamente utilizada que se baseia na marcação de DNA e na hibridação em membranas. É referido como uma técnica de transferência porque envolve a transferência de ácidos nucleicos de géis para um suporte sólido de uma membrana e imobilização de DNA na membrana. A detecção do fragmento de DNA é feita usando uma fita complementar de DNA ou RNA que é chamada de sonda (algo que detecta é uma sonda) que hibridiza com o fragmento de DNA.

A transferência de DNA do gel para a membrana é realizada pelo fluxo de tampão através do pavio, gel, membrana e acima nas camadas de papel adsorvente. O gel é sobreposto em um pavio de papel de filtro (3 a 4 folhas) que mergulha no tampão contido em um recipiente (Fig. 23.4). A membrana de hibridação é colocada acima do gel.

Uma pilha de toalhas de papel fica acima da membrana. As toalhas de papel adsorventes servem para puxar o tampão através do gel por ação capilar. O fluxo do tampão transporta as moléculas de DNA do gel para a membrana (nitrocelulose ou membrana de náilon). As membranas de nylon são consideradas superiores por terem maior capacidade de ligação aos ácidos nucléicos e por serem mais fortes do que as membranas constituídas de nitrocelulose.

Fragmentos grandes de DNA requerem mais tempo para serem transferidos para fora do gel do que fragmentos mais curtos. Para superar essas diferenças de tempo, o DNA submetido à eletroforese no gel é pré-tratado para depurinação, o que também desnatura os fragmentos em fitas simples, tornando-os acessíveis para hibridização com a sonda.

Após a transferência do gel, os fragmentos de DNA são fixados (permanentemente fixados) à membrana por aquecimento a 80 ° C no forno ou por reticulação usando radiação UV. Os fragmentos de DNA ficam fixos ou impressos na membrana nos mesmos locais que no gel (réplica).

Em outras palavras, o arranjo espacial do DNA no gel é preservado na folha. Após a fixação, a membrana é incubada em uma solução contendo DNA de fita simples marcada ou sonda de RNA que é complementar à sequência de DNA transferida por blot a ser detectada. Em condições apropriadas, a sonda de ácido nucleico marcada hibridiza com o DNA na membrana.

Após a hibridação, a membrana é lavada para remover as sondas não ligadas, de modo que as únicas moléculas marcadas restantes são aquelas que hibridizaram com o DNA alvo. A membrana é então colocada em contato com um filme de raios-X para autorradiografia que revelará a posição do fragmento de DNA desejado.

Usando controles de calibração de tamanho, o tamanho de qualquer fragmento da mistura de fragmentos pode ser determinado. Variações de Southern blotting são chamadas de manchas de pontos e slots. A amostra é manchada diretamente na folha de náilon ou nitrocelulose sem separação prévia no gel.

Esta técnica é semelhante à técnica de Southern blotting e é usada para identificar uma molécula de RNA específica a partir de uma mistura de RNAs separados em um gel. As moléculas de RNA separadas em um gel são transferidas para uma membrana e sondadas da mesma forma que o DNA é transferido e testado em Southern blotting. Um gene clonado possuindo sequência complementar ao RNA sendo pesquisado pode ser usado como uma sonda.

Resumidamente, é uma combinação das técnicas notáveis ​​recentes que estão encontrando ampla aplicação. A geração de fragmentos de restrição, eletroforese em gel, técnicas de blotting, clonagem, juntamente com a hibridização de ácido nucleico, permitem que uma sequência de DNA específica seja analisada em um genoma completo.

Para identificar um gene individual, o DNA do organismo é purificado e clivado por enzimas de restrição. Os fragmentos de restrição são separados por eletroforese em gel. Os fragmentos são desnaturados para obter fitas simples e, em seguida, marcados com uma sonda radioativa.

A sonda que consiste em DNA ou RNA de fita simples deve ter uma sequência que possa emparelhar com o gene de interesse. A sonda hibridiza com sua sequência complementar sob condições apropriadas de temperatura, sal e pH. A exposição ao filme de raios-X indica a ligação da sonda pela presença do sinal radioativo.

Moléculas de DNA recombinante:

A geração de moléculas de DNA recombinante é um processo de inserção de um gene de interesse ou DNA doador em uma molécula de DNA de uma fonte diferente que atua como um vetor ou veículo para o DNA doador. O primeiro passo é obter o DNA do doador, ou seja, isolar o gene de interesse. O DNA genômico do organismo doador é isolado, purificado e cortado com uma endonuclease de restrição que faz cortes escalonados com extremidades adesivas no DNA do doador.

As extremidades adesivas consistem em caudas de filamento único salientes ou coesivas. Assim, o DNA do doador será cortado em um conjunto de fragmentos de restrição de acordo com as localizações dos locais de restrição. O DNA do vetor, que poderia ser um plasmídeo bacteriano ou genoma do bacteriófago λ (descrito posteriormente), também é cortado com a mesma enzima de restrição que foi usada para o DNA do doador.

Os fragmentos assim produzidos teriam as mesmas extremidades coesivas ou pegajosas complementares, permitindo-lhes hibridizar com as extremidades pegajosas nos fragmentos de DNA do doador. As moléculas hibridizadas produzidas não possuem estruturas de fosfato de açúcar covalentemente unidas completas. Para selar as estruturas, a enzima DNA ligase é usada, a qual faz ligações fosfodiéster e liga os dois covalentemente para formar uma molécula de DNA recombinante (Fig. 23.5).

Outras fontes de DNA doador:

Além do DNA genômico de um organismo doador, é possível usar sequências de RNA como doadores. O primeiro passo é sintetizar uma cópia do DNA do RNA usando a enzima transcriptase reversa. O DNA complementar ou cDNA obtido pode ser usado como DNA doador incorporando-o no DNA do vetor e fazendo uma molécula de DNA recombinante.

Em estudos que requerem a caracterização do transcrito do gene, ou seja, o mRNA, um cDNA é preparado usando o mRNA como molde para a transcriptase reversa. Isto é particularmente útil porque o mRNA tem vida curta e as técnicas para isolar moléculas de mRNA individuais não estão disponíveis. Os cDNAs podem ser usados ​​para aprender sobre a variedade de mRNAs em uma célula e o número de cópias de diferentes mRNAs presentes em uma célula.

Se a sequência a ser inserida para fazer uma molécula de DNA recombinante não puder ser isolada do DNA genômico natural, nem como cDNA, então o DNA sintetizado quimicamente pode ser usado. A síntese química de oligonucleotídeos, isto é, fragmentos de DNA de 15 a 100 nucleotídeos de comprimento, pode ser desenvolvida por técnicas altamente automatizadas.

Vetores para gerar DNA recombinante:

Um vetor deve ser uma pequena molécula capaz de replicação independente em uma célula hospedeira viva deve ter locais de restrição convenientes que podem ser usados ​​para a inserção do DNA a ser clonado deve permitir fácil identificação e recuperação da molécula recombinante. Os vetores também são chamados de veículos de clonagem ou replicons. Os sistemas básicos de vetor usam plasmídeo bacteriano ou DNA do bacteriófago λ como vetores.

Os plasmídeos são pequenas moléculas circulares de DNA que se replicam independentemente do cromossomo bacteriano. As moléculas de plasmídeo são divididas com precisão em células-filhas. A maioria dos plasmídeos existe como moléculas de DNA de fita dupla.

Se ambas as fitas do DNA são círculos intactos, a molécula é descrita como um DNA de círculo covalentemente fechado (DNA CCC), se apenas uma fita estiver intacta, então o DNA de círculo aberto (DNA OC). Nem todos os plasmídeos são circulares, alguns existem como moléculas lineares, como as de Streptomyces e Borrelia.

O DNA do plasmídeo tem 2 a 4 kb de comprimento e uma sequência que é a origem da replicação, que sinaliza à DNA polimerase da célula hospedeira para replicar a molécula de DNA. Os plasmídeos têm a vantagem de transportar genes para resistência a antibióticos, de modo que bactérias com fenótipo de resistência a antibióticos (plasmídeos) podem ser selecionadas.

Suponha que queremos inserir o gene X no genoma humano em um vetor plasmídeo. Os fragmentos de DNA humano são preparados por corte com uma enzima de restrição, por exemplo EcoRI, e a mesma enzima de restrição é usada para cortar o DNA de plasmídeo (Fig. 23.3).

As extremidades pegajosas terão extremidades coesivas de fita simples complementares que hibridariam umas com as outras. Entre o grande número de fragmentos produzidos a partir do DNA humano, apenas uma fração muito pequena teria o gene X.

Para isolar o fragmento com o gene X, os digeridos de restrição de DNA humano e plasmídeo são incubados juntos, junto com a DNA ligase. Durante a incubação, as extremidades adesivas dos dois tipos de DNA tornam-se ligadas por hidrogênio entre si, suas extremidades quebradas seladas por ligase para formar moléculas circulares de DNA recombinante.

Agora haveria um grande número de diferentes moléculas de DNA recombinante, cada uma contendo um plasmídeo bacteriano com um fragmento de DNA humano. Para isolar aqueles plasmídeos que possuem o gene X humano, o processo de clonagem de DNA deve ser feito.

Os vetores do bacteriófago λ podem conter inserções de DNA estranho de até 15 kb. Existem dois tipos básicos de vetores de fago λ, vetores de inserção e vetores de substituição. O DNA do fago λ de tipo selvagem contém vários locais alvo para a maioria das endonucleases de restrição comumente usadas, portanto, não é adequado como um vetor.

Derivados do fago de tipo selvagem foram, portanto, produzidos que têm um único local alvo no qual o DNA estranho pode ser inserido (vetores de inserção), ou têm um par de locais definindo um fragmento que pode ser removido e substituído por DNA estranho ( vetores de substituição).

Uma vez que o DNA do fago pode acomodar apenas cerca de 5% a mais do que seu complemento normal de DNA, os vetores são construídos com deleções para aumentar o espaço dentro do genoma. As moléculas de DNA λ mais curtas geralmente usadas têm 25% de deleção.

O DNA estranho é primeiro ligado ao DNA do fago (Fig. 23.6). As moléculas recombinantes são então introduzidas em células de E. coli. A replicação do DNA produz numerosos descendentes de fagos contendo o fragmento de DNA estranho. Este fragmento pode ser isolado do resto do DNA do fago por digestão com endonuclease de restrição e eletroforese em gel.

Os fagemídeos são vetores plasmídicos que carregam a origem de replicação do genoma de um bacteriófago filamentoso de fita simples, como M13 ou f1. Os fagomídeos combinam as melhores características dos plasmídeos e dos vetores bacteriófagos de fita simples.

Eles têm dois modos separados de replicação: como um plasmídeo de DNA de fita dupla e como um modelo para produzir cópias de fita simples de uma das fitas do fagemídeo. Um fagemídeo pode, portanto, ser usado da mesma maneira que um vetor plasmídeo, ou pode ser usado para produzir partículas de bacteriófago filamentosas que contêm cópias de fita simples de segmentos clonados de DNA.

Alguns estudos requerem a inserção de grandes fragmentos de DNA estranho para os quais os vetores do fago λ não são adequados. Os vetores de cosmídeo e cromossomo artificial de levedura (YAC) preparados artificialmente são úteis para esta finalidade. DNA estranho de até 45 kb de comprimento pode ser acomodado em vetores cosmídeos. Os vetores cosmídeos podem existir como plasmídeos, mas também contêm as extremidades de fita simples pendentes complementares do fago λ.

A presença de sequências de bacteriófago λ em vetores cosmídeos permite o empacotamento do DNA recombinante em partículas de fago. O fago λ então introduz essas moléculas de DNA recombinante de grande tamanho nas células receptoras de E. coli. Os cosmídeos também contêm origens de replicação e genes para resistência a medicamentos, de modo que podem se replicar como plasmídeos em células bacterianas (Fig. 23.7).

No entanto, porque os vetores cosmídeos não possuem as sequências de fago essenciais necessárias para formar as partículas de fago da progênie, a molécula de DNA recombinante depende das sequências de plasmídeo no cosmídeo. Once inside the recipient E. coli cell, the recombinant cosmids form circular molecules that replicate extra-chromosomally in the same manner as plasmids.

The YAC vectors can accommodate still larger fragments, from a hundred to a thousand kilo-bases in length, that is one million base pairs. As the name implies, YACs are artificial versions of normal yeast chromosomes and replicate as chromosomes in yeast cells.

They contain all the elements of a yeast chromosome that are required for replication during S phase, one or more origins of replication, and segregation to daughter cells during mitosis, telomeres at the ends of the chromosome, as well as centromere to which spindle fibres can attach during chromosome separation.

In addition to these elements, YACs are constructed to contain the following: a gene whose encoded product allows those cells containing the YAC to be selected from those that lack the element the DNA fragment to be cloned. Yeasts can take up DNA from the medium, allowing YACs to be introduced into host yeast cells.

For introducing such large-sized DNA fragments (100 to 1000 kb in length), it is necessary to use restriction enzymes that recognise particularly long nucleotide sequences, 7 to 8 nucleotides containing CG di-nucleotides.

For example, the restriction enzyme NotI recognises the 8 nucleotide sequence GCGGCCGC, which cleaves mammalian DNA into fragments approximately one million base pairs long. These fragments can then be incorporated into YACs and cloned within host yeast cells. YAC technology has been used extensively in the Human Genome Project.

Bacterial artificial chromosomes (BACs) are based on the F factor of E. coli, and are among the most widely used vectors for very large DNA fragments of up to 300 kb. BAC vectors are 6 to 8 kb in length and include genes for essential functions such as replication (genes repE, and oriS), genes for regulating copy number (parA and parB), and genes for resistance to the antibiotic chloramphenicol.

Genomic DNA Libraries:

Collections of DNA fragments obtained by DNA cloning from the entire genome of an organism constitute a DNA library. Basically, the genomic library is a collection of bacteria, typically E. coli, each carrying a fragment of DNA from the genome. In one approach for making a DNA library, all the DNA from an organism is cut into fragments with a restriction enzyme.

Each segment is inserted into a different copy of the vector, thereby creating a collection of recombinant DNA molecules, which collectively represent the entire genome. These are then used to transform separate recipient bacterial cells, where they are amplified. The resulting collection of recombinant DNA-bearing bacteria is called a genomic library.

If the cloning vector used could accommodate an average insert size of 10 kb, and if the entire genome size is 100,000 kb, then we can expect 10,000 independent recombinant clones to represent the library of the whole genome.

In another approach, genomic DNA is cleaved by one or two restriction enzymes that recognize very short nucleotide sequences such as Sau3A (recognises GATC) and HaeIII (recognises GGCC). The enzymes are used in low concentration so that only a small percentage of target sites are actually cleaved.

One can expect that the small-sized tetra-nucleotide sequence would occur by chance at very high frequency, so that every portion of the DNA could yield fragments. After partial digestion of DNA, the fragments are separated by gel electrophoresis. Fragments about 20 kb in length are incorporated into phage λ heads from which about half a million plaques are generated, to ensure that every portion of the genome is represented (Fig. 23.8).

The important point in this method is that, due to low concentration of the restriction enzyme, the DNA is randomly fragmented, and each and every target site is not cleaved. The phage recombinants produced constitute a permanent collection of all the DNA sequences in the genome.

Whenever a particular sequence is required for isolation from the library, phage can be grown in bacteria. Each of the plaques produced would have originated from infection of a single recombinant phage, and can be screened for the presence of a particular sequence.

Positional Cloning or Chromosome Walking:

When there is no biological information about a gene, but its position can be mapped relative to other genes or markers, it is called positional cloning. The approach involves cloning a gene from its known closest markers. It requires only the mapped position of the gene. On the basis of this information, researchers can locate the nearest physical markers.

The closest linked marker is used to probe the genomic library. DNA cleaved randomly, as described above, generates overlapping fragments that can be used in the analysis of regions of the chromosome extending out in both directions from a particular sequence, the gene of interest. These extended regions or linked markers serve as starting points for the process of chromosome walking (Fig. 23.11).

Using a small sequence at the end of the linked marker, let us call it M1, as a labelled probe, find a clone in the library. The positive clone that is found will lead to identification of an adjacent gene segment which is now a second marker. Isolate the end sequence of second marker (M2) and use it to probe library and find another adjacent genomic segment which becomes the third marker.

Isolate end of third marker (M3) and use it to again probe for the next adjacent segment, and so on. Using the new fragments as labelled probes the process is repeated in successive screening steps, leading to isolation of more and more of the original DNA molecule. Because this process consists of steps, hence the name chromosome walking. This approach allows study of the organisation of linked sequences over a considerable length of the chromosome.

Chromosome jumping is a variation of chromosome walking using larger high capacity vectors to bridge un-clonable gaps. Whereas in chromosome walking each step is an overlapping DNA clone, in chromosome jumping each jump is from one chromosome location to another without “touching down” on the intervening DNA.

The gene for cystic fibrosis (CF), a severe autosomal recessive disorder in humans, was identified by chromosome walking and jumping. Cloning of the CF gene was a breakthrough for studying the biochemistry of the disorder (abnormal chloride channel function), for designing probes for prenatal diagnosis, and for potential treatment by somatic gene therapy or other means.

The method described above for making genomic DNA libraries can also be used for generating cDNA libraries. A cDNA library would contain hundreds of thousands of independent cDNA clones, representating collections of cDNA inserts. It may be recalled that cDNA is produced from the mRNA by using reverse transcriptase.

If a specific gene that is being actively transcribed in a particular tissue is desired for study, then it is considered useful to convert its mRNA into cDNA and make a cDNA library from that sample. A cDNA library represents a subset of the transcribed regions of the genome, hence the cDNA library would be smaller than a complete genomic library.

Screening DNA Library for a Specific Clone:

Any sequence for which a probe is available can be isolated from a recombinant library. Two types of probe can be used, those that recognise a specific DNA sequence and those that recognise part of a specific protein.

Probes for DNA Sequences:

A probe that consists of a single strand of DNA would be able to find and bind to other complementary denatured (single-stranded) DNAs in the library and specifically hybridise with it. The procedure for identification of a specific clone in a library is carried out in two steps. First, the recombinant phages are plated on E.coli, and each phage replicates to produce a plaque on the lawn of bacteria.

The pattern of plaques of the library on the petri dish are transferred to an absorbent nitrocellulose membrane by laying the membrane directly on the surface of the medium. When the membrane is peeled off, the plaques remain clinging to its surface, are lysed in situ and DNA is denatured. The membrane is incubated in a solution containing radiolabeled probe that is specific for the sequence being searched (Fig. 23.9).

Generally, the probe is a cloned piece of DNA that has a sequence homologous to that of the desired sequence. The single-stranded probe will bind to the DNA of the clone being searched. To determine the position of the positive clone, the position of the radioactive label can be found out by placing the membrane on the X-ray film.

Emissions from the decay of radioactive label will reduce the grains in X-ray film, seen as a dark spot after developing the film. The procedure is called autoradiography, the exposed film an autoradiogram. The probe used for finding sequence of interest in a library can also be labelled with a fluorescent dye.

In that case the membrane is exposed to a particular wavelength of light that would excite fluorescence and a photograph of the membrane is taken. The position of the spot of label (radioactive or fluorescent) indicates the location of the DNA segments containing sequences complementary to the probe.

Probes for Protein Products of Genes:

The protein product of a gene can be used to find the clone of its corresponding gene in a library. This can be accomplished if the amino acid sequence of the protein product is known, and the protein can be isolated in a purified form. Antibodies that bind specifically with unique protein molecules are used as probes to screen an expression library. These libraries are special cDNA libraries generated by using expression vectors.

An expression vector is a cloning vector containing the regulatory sequences necessary to allow transcription and translation of a cloned gene. Expression vector produces the protein encoded by a cloned gene in the transformed host. Expression vectors are essentially derivatives of a phage or plasmid cloning vector that has been modified by addition of a promoter specific to the host.

The cloned gene in such an expression vector is placed under the control of the promoter that ensures transcription of the cloned gene in the appropriate host cell. Expression vectors designed in this manner can yield high levels of recombinant protein in host cells that can be purified for structural and functional characterisation.

To make the cDNA library, the cDNA to be cloned is inserted into the special phage vector downstream from the bacterial promoter, in the correct triplet reading frame which ensures that the foreign DNA is transcribed and translated during infection.

Phages that have incorporated the gene of interest form plaques that contain the protein encoded by that gene. A membrane is laid over the surface of the medium and removed with some cells of each colony attached to the membrane.

The locations of these cells are identical to their positions in the original petri dish (replica plating). The membrane is dried, and immersed in a solution containing antibody. The antibody will bind only to the protein product of the gene of interest.

For detection of positive clones, a second antibody is prepared that is specifically against the bound antibody and labeled radioactively or with a fluorochrome. The plaque having the gene of interest is thus located on the replica plate through detection of bound antibody.

It is frequently considered useful to express high levels of a cloned gene in eukaryotic cells rather than in bacteria. The reason is that post-translational modifications of the protein (such as addition of carbohydrates or lipids) that take place in eukaryotic cells would take place normally.

One system frequently used for protein expression in eukaryotic cells involves infection of insect cells by baculovirus vectors, which yield very high levels of protein product of a gene. High levels of protein expression can also be achieved by using appropriate vectors in mammalian cells.


Examples of Recombinant DNA Technology

Recombinant DNA technology is used in a number of applications including vaccines, food products, pharmaceutical products, diagnostic testing, and genetically engineered crops.

Vaccines

Vaccines with viral proteins produced by bacteria or yeast from recombined viral genes are considered safer than those created by more traditional methods and containing viral particles.

Other Pharmaceutical Products

As mentioned earlier, insulin is another example of the use of recombinant DNA technology. Previously, insulin was obtained from animals, primarily from the pancreas of pigs and cows, but using recombinant DNA technology to insert the human insulin gene into bacteria or yeast makes it simpler to produce larger quantities.

A number of other pharmaceutical products, like antibiotics and human protein replacements, are produced by similar methods.

Food Products

A number of food products are produced using recombinant DNA technology. One common example is the chymosin enzyme, an enzyme used in making cheese. Traditionally, it is found in rennet which is prepared from the stomachs of calves, but producing chymosin through genetic engineering is much easier and faster (and does not require the killing of young animals). Today, a majority of the cheese produced in the United States is made with genetically modified chymosin.

Diagnostic Testing

Recombinant DNA technology is also used in the diagnostic testing field. Genetic testing for a wide range of conditions, like cystic fibrosis and muscular dystrophy, have benefited from the use of rDNA technology.

Crops

Recombinant DNA technology has been used to produce both insect- and herbicide-resistant crops. The most common herbicide-resistant crops are resistant to the application of glyphosate, a common weed killer. Such crop production is not without issue as many question the long term safety of such genetically engineered crops.


Steps in Recombinent DNA Technology

Isolate DNA then cutting the DNA with restriction enzymes after that ligate into cloning vector then transform recombinant DNA molecule into host cell so that each transformed cell will divide many, many times to form a colony of millions of cells, each of which carries the recombinant DNA molecule (DNA clone).

  1. Isolation of Desired Gene
  2. Preparation of Vector
  3. Ligation
  4. Introduction of Recombinant DNA into Host cell
  5. Selection of recombinant host cell
  6. Expression of cloned gene

Isolation of desired DNA

For making recombinant organisms, a desired DNA fragment has to be introduced into the host cell, these desired DNAs can be obtain from the total genome of the cell either by restriction digestion (with restriction endonucleases or by mechanical shearing). The desired gene can be clone is located in the cell DNA of the source organisms along with several genes so firstly, it should be isolated from other genes of the cell DNA. For this purpose two methods are follows to isolate desired DNA from the genome of the cell. They are restriction digestion and mechanical shearing.

DNA Extraction

  1. Preheat 5ml CTAB (add 10μl mercaptoethanol to each 5ml CTAB) in a blue-topped 50ml centrifuge tube at 60-65°C. Remove and discard midribs and wrap laminae in aluminum foil and freeze in liquid nitrogen. 0.5 – 1.0 gm tissue/5ml CTAB (Can store leaf material after liquid Nitrogen – 1-2 days at –20°C or –80°C for longer periods)
  2. Gently crumble leaf tissue over cold pestle of liquid nitrogen. Grind frozen leaves with one spatula of fine sand add 0.5 spatula of PVPP powder after grinding.
  3. Scrape powder into dry tube and add pre-heated buffer and mix gently. Avoid leaving dry material around rim of tube. Adjust CTAB volume to give a slurry-like consistency, mix occasionally.
  4. Incubate for 60 min at 60°C
  5. Add equal volume of chloroform/iso-amyl alcohol (24:1), Mix for about 3min, then transfer contents to narrow bore centrifuge tubes. Balance by adding extra chlor/iso. Spin 5,000rpm for 10min (ensure correct tubes used), brake off. (For extra pure DNA isolation – spin and retain supernatant before chloroform extraction).
  6. Remove supernatant with wide-bore pastette (cut off blue tip) to clean tube, repeat chloroform extraction once. Supernatant should be clear, though may be coloured.
  7. Precipitate DNA with 0.66 vol. of cold isopropanol – can leave overnight. Spool out or spin down DNA, 2min at 2,000rpm.
  8. Transfer to 5ml wash buffer for 20min.
  9. Dry briefly and resuspend in 1ml T.E. (can be left overnight)
  10. Add 1μl 10mg/ml RNase to each 1ml T.E./DNA mixture and incubate for 60min at 37 °C. (If RNase in the sample doesn’t matter – stages 11 and 12 may be omitted)
  11. Dilute with 2 volumes TE and add 0.3vol 3M Sodium acetate (pH 8) +2.5 vol. cold 100% ethanol
  12. Spool DNA out. Air dry and resuspend in 0.5 to 1ml TE or water (takes time) and freeze until required.

Cutting DNA

Restriction Digestion

Restriction digestion is the cutting of DNA into fragments by restriction enzymes.The total DNA of an organism is treated with restriction enzymes. These enzymes cut the cell DNA into many fragments each fragment is differing in their size and molecular weight. These restriction enzymes cut the DNA into blunt end and cohesive end depending upon the mixture of these DNA fragments is electrophoresed on an agarose gel for a particular time By electrophoresis the mixture of this DNA fragments get separated on the basis of their size and molecular weight. Each DNA fragment obtained from electrophoresis band is cloned into a suitable vector.

The restriction enzyme may cut the DNA at the middle of desired gene and make it useless.

Mechanical Shearing

Genomic DNA is subjected to mechanical forces to cut genomic DNA into small fragments. Sonication with ultrasound cut this DNA randomly with the size of about 300-325 bp.

Limitations

Each time it produces new DNA fragments This method cannot be applied for Eukaryotic organism because of presence of introns.

Joining DNA

Recombinant DNA is a hybrid DNA formed by joining a desired foreign DNA and a vector DNA, It is indicated by rDNA. The vector DNA and genomic DNA fragments are mixed together. Cohesive end of the vector DNA anneals with genomic DNA fragment by complimentary base pairing and there is nick between these two DNA ends.

This nick is sealed by an enzyme called DNA ligase, It makes the Phosphodiester bond in between these two DNA fragments. Sometimes adapters, linkers and homopolymer tail are also used to join blunt ended DNA molecules.

Transformation

The recombinant DNA can be introduced into the host cell by direct transformation and indirect transformation. In direct method, bacterial cell intake the recombinant DNAs in the medium like microinjection, liposomes, electroporation and particle bombardment method. In indirect method the pathogenic agents such as bacteriophage and Agrobacterium pick up the recombinant DNA and introduced it into plant cell.

DNA clone is a section of DNA that has been inserted into a vector molecule and then replicate in a host cell to form several copies.


DNA Structure, Replication, and Technology - Recombinant DNA

In the most recent Spider-Man movie, a mutant spider bit Peter Parker and passed its spider genes to him, giving him super strength, vision, and web-slinging action. Therefore, in this case, Spider-Man exists because recombinant DNA from spider genes entered the human genome of Peter Parker.

If you are a Spider-Man fan, you will know the original story had Peter Parker bitten by a radioactive spider. Unfortunately, that method of transferring spider powers is highly unlikely, knowing what we know about DNA. Making recombinant DNA involves taking a gene, usually from an eukaryote, and putting it into a bacterial plasmid.

Many people fear that manipulating recombinant DNA is akin to "playing God," and some non-Spider-Man films play off those fears with the evil scientist character. Movies like Rise of the Planet of the Apes, The Island of Doctor Moreau, e Jurassic Park all feature evil scientists doing evil science with evil recombinant DNA. However, this technology has far more advantages than disadvantages, and the chances of creating super apes that will wipe out humanity are very small. Hey, we at Shmoop admit that super apes are super scary.

We will discuss the advantages and disadvantages of recombinant DNA technology in the "Biotechnology" section. For now, let's pretend we're scientists making recombinant DNA. And just for fun, let's be evil about it.

Yes! Even You Can Make a Super Ape!

So you want to make an army of super apes, but where do you start? While the following section is completely hypothetical, it shows how scientists make genetically recombinant organisms.

Disclaimer: do not tell your friends after reading this that you know how to make an army of super apes. That secret will always remain in the vaults at Shmoop. We can neither confirm nor deny that Shmoop has an army of super apes.

Let's make some hypothetical super apes. First, you start off with a vector, or a specific plasmid that is used for generating recombinant DNA. Vectors come in a variety of forms, but they must have three sequences:

  1. They need an origin of replication (oriR) site, which is a sequence that signals bacteria to replicate this plasmid whenever they replicate.
  2. There must be an antibiotic resistance gene, which is important for selecting bacteria that have the recombinant plasmid. When a scientist grows bacteria, he will add an antibiotic to kill all bacteria that do not have the plasmid. The antibiotic resistance gene will allow the bacteria that have the plasmid to stay alive. Score.
  3. UMA multiple cloning site (MCS) is important for facilitating insertion of the target gene into the vector. Putting the MCS into a lacZ ou ccdB gene allows selection for bacteria that have the target gene inserted into the vector. This is because the target gene will disrupt the lacZ or ccdB gene, and one can easily test the activity of either of these genes by looking for colonies on a plate that lack the relevant gene activity.

UMA multiple cloning site is a DNA sequence that contains many restriction enzyme sites. Restriction enzymes cleave DNA at specific palindromic sequences, such as GGATCC, GAATTC, and GTTAAC. There are thousands of different restriction enzymes that each cleave a specific sequence. MCS sequences have sites for common restriction enzymes, and these enzymes were designed to cut the DNA only in the MCS and nowhere else in the vector.

Restriction enzymes cut in a way that either leaves sticky ends, where each strand is cut at a different position, leaving 2–5 bases of single-stranded DNA, or blunt ends, where the same spot on both strands is cleaved. Sticky ends are generally easier to handle, and different restriction enzymes often leave the same overhanging sequences, so you can cut your vector with one enzyme and your DNA insert with another enzyme, and the two sticky ends are then called compatible. Check out this link. Match.com could learn something from restriction enzymes.

Once you have cut your vector in the MCS, or elsewhere in the vector that has a unique restriction site, you need to join it together. How do you join the two sequences? Naturally, you join them in the same way you join everything else: glue!

Wait, not actual glue. Elmer's does not make bottles that small. Instead, we use a "molecular glue" called DNA ligase. DNA ligase is an enzyme that takes a free phosphate from the 5' end of one piece of DNA and attaches it to the free –OH at the 3' end of the other piece of DNA.

Above is a schematic of how most scientists make recombinant DNA plasmids. The target gene here is our SUPER APE gene. The only concern with making a plasmid is that there is a DNA sequence limitation. You cannot insert a DNA sequence into a traditional vector if it is over 20 kilobases (kb) in length. What if your hypothetical SUPER APE gene is huge (> 300 kb)? That will put a damper on your plot of world domination, right? Not at all, my fiendish friend!

Our scientist minions, er, friends have developed cosmids, or plasmids that can handle large pieces of DNA and contain cos sequences from viruses that infect bacteria, called bacteriophages. Cosmids can handle 50-kb inserts because they integrate em the bacterial genome rather than hanging outside of the bacterial genome, like plasmids.

If you want even more space for DNA, you can use bacterial artificial chromosomes (BACs), which handle 150–350 kb sequence inserts. BACs are similar in size to most other plasmids (5–7 kb in length), though they contain parA e parB genes, as well as oriS sites and the repE e repF genes for regulating the BAC (and its insert) so that it is properly replicated, maintained, and segregated into progeny cells. They basically act like a second bacterial genome in bacteria, and those sequences make sure your giant SUPER APE gene is replicated in the bacteria. Stick your SUPER APE gene into the BAC, and you are all set for world domination.

Brain Snack

I Have Made a Plasmid: Now What?

All those months working diligently in the lab to make your SUPER APE plasmid have come to fruition (Heaven help us all…). You're ready to lead an army of super apes. But, how do you go from plasmid to super ape?

There are two strategies, and it depends on the biology of your SUPER APE gene. Sorry, you need to do more research on how SUPER APE makes apes super. There are a few possibilities on why current apes are not super: either they lack the enzyme that makes them super, or they have the SUPER APE gene already but it is defective.

Let's say that apes have a dysfunctional SUPER APE gene. We can put a functional SUPER APE gene into ape embryos, and they will make the super ape gene. How does one insert a gene into an embryo? One way is to apply an electric current to the embryo, which opens the cells to take in our SUPER APE BAC. Alternatively, you can take a tiny syringe and inject the DNA into the embryo. However, both methods have several problems and are incredibly difficult to do.

There is potentially a major biological concern if we add functional SUPER APE genes to an embryo. Inserting DNA into an embryo will lead to every cell in the body having that DNA. Perhaps not every part of the body needs a functional SUPER APE gene to make the ape super. What if SUPER APE kills apes when expressed in the heart or lungs? This might be whythe gene is nonfunctional in all apes.

You tried adding your plasmid to embryos, and all your apes died or were never born. That is a bummer, and not just because you have a lot of dead apes on your hands now. To avoid this, we could target SUPER APE to specific tissues, such as muscles and blood cells.

There are many tissue-specific markers, or transmembrane proteins, that are expressed in certain cell types. Therefore, we can use viruses that infect cells expressing muscle and blood markers to put our SUPER APE gene in muscle and blood cells. As a disclaimer, this would only be possible if SUPER APE were a small gene (< 10 kb) using current technology. But let's assume that you are way smarter than every scientist in the world and move on. Super apes here we come!

Oops! When we put the SUPER APE gene into blood and muscle cells, it integrates into the genome and is immediately silenced by DNA methylation and tight histone packing. We need to deliver the SUPER APE gene as a protein into blood and muscle cells. Therefore, we need to make SUPER APE protein in bacteria and deliver it to our apes however, we cannot use the same plasmid that we were using before.

"Why not?" you ask. We were using the SUPER APE gene, which includes introns, and if we are making protein, we do not want intron sequences, because bacteria do not know how to splice out introns. You will have a nonfunctional SUPER APE protein.

Instead of the SUPER APE gene, we want to put the cDNA (complementary DNA) do SUPER APE into a plasmid, which will be much smaller than the gene. A cDNA is a DNA made from an RNA using reverse transcriptase from retrovírus.

While every other polymerase you have heard of either makes DNA from a DNA template (DNA polymerase) or RNA from DNA (RNA polimerase), retroviruses can make DNA from an RNA template, though there are viruses that make RNA from RNA templates. Reverse transcriptase is the enzyme that makes DNA from RNA, and we can purify SUPER APE mRNA and add reverse transcriptase to make cDNA.

This cDNA is inserted into a plasmid that has a promotor to drive expression in bacteria. We can then make lots of super ape protein in bacteria. How we get it into muscle and blood cells is a trickier problem, which we will leave to you to solve (and is probably another reason why we do not already have super apes).

One possible way to deliver super ape proteins to blood and muscle cells would be through ingesting food that makes super ape protein. Therefore, we could have plants make super ape protein and feed those plants to our apes.

The most trusted way of delivering genes to plants for biotechnology is using Agrobacterium tumerfaciens. This bacteria infects plants and causes tumors, collectively known as crown-gall disease. Agrobacterium transfers a portion of its tumor inducing (Ti) plasmid DNA, called T-DNA,which causes the plant to make opines, or compounds that the bacterium uses for energy and carbon sources.

Scientists have used this genetic transfer as a tool for gene delivery into plants, much in the same way the super ape protein can be made in bacteria. Putting the SUPER APE cDNA into the Ti plasmid could allow plants to make the super ape protein. Our apes can eat the super-ape-expressing plants, making them super strong for our invincible army. The bonus is that if they get out of control, we stop feeding them super ape protein plants. Hopefully, they do not learn how to grow their own super ape plants. Then, it would be curtains for us all.

Can We Stop Talking About Super Apes?

Much of what we previously described are techniques that real scientists use to actually make proteins and deliver genes for numerous biotechnology applications. What are some real, non-super-ape applications of recombinant DNA technology?

There are so many applications for recombinant DNA technology: medical applications, including gene therapy and vaccines the creation of genetically modified crops that are resistant to pesticides or that make extra vitamins and minerals and bacteria that can clean oil spills and even make "fake snow." While the applications of recombinant DNA technology are numerous, its limitations are its potential effects on our ecosystem. A longer discussion of this can be found in the "Biotechnology" section.

Brain Snack

Scientists use protein-making bacteria that improve the ability of water to form ice crystals. Here is a video of how scientists found those bacteria.


How To: Recombinant Protein Construct Design

Creating recombinant proteins has become much easier over the past few decades. However, those with the skills to do design such constructs are usually limited to the biochemists who study proteins. With the increase of protein therapeutics on the market for the treatment of cancer and other diseases, construct design has become a more relevant skill in the drug discovery field. Even if you are not directly responsible for making these constructs, knowing how they are created could give you important insight into how they work and why they were made. Thankfully the actual cloning process has been optimized to be faster than ever, with DNA synthesis becoming an even more attractive way to get the actual recombinant DNA. The design process can remain a challenge, but these few simple guidelines can help.


The first, and maybe most obvious step of construct design is getting ahold of your protein&rsquos template DNA. This can usually be found easily on an online genomic database. The next step should be to run an alignment with your protein&rsquos amino acid sequence against one or more organisms. The alignment will give you a readout of matching sequences and their percent homology with the original input sequence. This information can help find proteins of the same family, and any homologs that might be present in other organisms. Using this data, you can now begin to decipher your own protein sequence. The basic rules are conserved sequences between proteins usually denote a critical region of the protein important for structure or function. Unique sequences tend to impart a unique function or characteristic or denote a region of the protein that has no critical function. Conserved sequences are usually shared across homologs, or families of proteins and unique sequences, particularly within otherwise conserved regions, and are different between proteins and a consequence of an organism&rsquos evolution in a particular environment. This information can also help you find previous or current research related to your project. If your protein has little to no previous work done on it, it can be hard to find a starting point. Often experiment design and optimization can take months or even years before they can produce consistent data. This background research is critical if you want to keep your project on track and on time.


Sometimes it can be enticing to try everything under the sun and create dozens of construct designs when starting a project. Simplicity, however, is a key factor in designing a good construct. There are many mutations you can make to your protein: from point mutations, to truncations, to complex combinations of protein domains connected by linkers. Too many mutations too quickly can give confusing results, however. A good rule is to keep the construct as close to the native sequence as possible. The addition of a tag is usually required in order to facilitate purification, but other than that, try and limit each construct to one mutation until you have data suggesting you should make more complex mutants. Mutations should also be chosen very carefully as it can take weeks or months to generate and test each set of mutants. Make a note of the charge, size, and relative location of the native residue, and decide which mutant to make based on your hypothesis and project goals. Run a quick check and compare your potential mutants to past mutants from other papers, and make sure each has a specific and expected outcome. his is often the hardest part of the cloning stage, so once it&rsquos done it&rsquos just a matter of doing the leg work in lab to finish up.


Designing your first construct can be an exciting opportunity or even just an interesting exercise of your skills and problem-solving. It&rsquos important to note that even if your cloning succeeds, the resulting construct may not readily purify due to any number of solubility or stability issues. Many proteins can easily be undone by a single mutation, resulting in insoluble protein, non-native oligomeric states, or very little to no yield in the expression system used. The overall challenge tends to be finding the right mutations that can test your hypothesis and produce usable protein for your experiments. I hope this short explanation was enough to help you understand construct design, and maybe even try it out for yourself.


Assista o vídeo: DNA Recombinante - Conceito, mecanismo e função - Biotecnologia - Engenharia Genética (Junho 2022).


Comentários:

  1. Kuno

    É compatível, informações úteis

  2. Mitch

    Wise não é quem sabe muito, mas aquele cujo conhecimento é útil =)

  3. Meldryk

    Eu compartilho totalmente o ponto de vista dela. Eu acho que essa é uma ótima ideia. Concordo com você.

  4. Cadhla

    Concorda, esta mensagem admirável

  5. Mazuru

    Please forgive me for interrupting you.

  6. Rinan

    Permita-se ajudá-lo?



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