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De onde vêm as lisinas durante a ubiquitinação?

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Eu sei que Ub forma uma ligação isopeptídica com a lisina, mas de onde vem a lisina?

Eles estão sempre disponíveis para a Ubiquitinação durante o processo de ubiquitinação? Existe uma lisina livre disponível em cada um dos Ub adicionais adicionados à cadeia? Depois que o primeiro Ub é adicionado à proteína alvo, o complexo E2 / E3 ainda precisa se ligar cada vez que um Ub é adicionado à cadeia?


O artigo da Wikipedia sobre Ubiquitin dá uma boa resposta às suas perguntas. Consulte os artigos referenciados se quiser obter respostas mais detalhadas.

Eles estão sempre disponíveis para a Ubiquitinação durante o processo de ubiquitinação?

Sim, este processo [Ubiquitinação] mais comumente liga o último aminoácido da ubiquitina (glicina 76) a um resíduo de lisina no substrato.

Existe uma lisina livre disponível em cada um dos Ub adicionais adicionados à cadeia?

A ubiquitina possui sete lisinas e cada uma delas pode ser ligada à glicina N-terminal da próxima ubiquitina.

Depois que o primeiro Ub é adicionado à proteína alvo, o complexo E2 / E3 ainda precisa se ligar cada vez que um Ub é adicionado à cadeia?

Sim, mas isso é mais complicado do que o mecanismo geral. Uma cadeia de poli-ubiquitina pode ser anexada apenas como uma única ubiquitina ou uma ou mais ubiquitinas podem ser conjugadas a um complexo ubiquitina-proteína existente. Ver, por exemplo, Brown et al e David et al.


Mecanismos de mono e poli-ubiquitinação: a especificidade da ubiquitinação depende da compatibilidade entre o núcleo catalítico E2 e os resíduos de aminoácidos proximais à lisina

Ubiquitinação envolve a ligação da ubiquitina aos resíduos de lisina nas proteínas do substrato ou em si mesma, o que pode resultar na monoubiquitinação ou polubiquitinação da proteína. A ligação da ubiquitina a diferentes resíduos de lisina pode gerar diversas estruturas substrato-ubiquitina, direcionando proteínas a diferentes destinos. Os mecanismos de seleção de lisina não são bem compreendidos. Ubiquitinação pelo maior grupo de ligases E3, a família RING E3 s, é catalisada por meio da cooperação entre a ubiquitina-ligase não catalítica (E3) e a enzima de conjugação de ubiquitina (E2), onde o RING E3 se liga ao substrato e o E2 catalisa a transferência de ubiquitina. Estudos anteriores sugerem que os locais de ubiquitinação são selecionados pelo posicionamento da lisina mediado por E3 em direção ao local ativo E2. Em última análise, em um nível catalítico, a ubiquitinação de resíduos de lisina dentro do substrato ou ubiquitina ocorre por ataque nucleofílico do resíduo de lisina na ligação tioéster que liga a cisteína catalítica E2 à ubiquitina. Um dos complexos RING E3 / E2 mais bem estudados é o complexo de proteína Skp1 / Cul1 / F box, SCF Cdc4, e seu cognato E2, Cdc34, que tem como alvo o inibidor de CDK Sic1 para poliubiquitinação ligada a K48, levando à sua degradação proteassomal. Nossos estudos recentes deste sistema modelo demonstraram que os resíduos em torno das lisinas Sic1 ou lisina 48 na ubiquitina são críticos para a ubiquitinação. Esta dependência de sequência está ligada a resíduos-chave evolutivamente conservados na região catalítica de Cdc34 e pode determinar se Sic1 é mono- ou poli-ubiquitinado. Nossos estudos indicam que os determinantes de aminoácidos na região catalítica Cdc34 e sua compatibilidade com os resíduos de lisina aceitadores circundantes desempenham papéis importantes na seleção de lisina. Isso pode representar um mecanismo geral para direcionar o modo de ubiquitinação em E2 s.


Principais componentes da reação APC

A ubiquitinação da proteína pelo APC requer a cooperação de quatro componentes da proteína: o núcleo do APC, a subunidade ativadora, E2 e o substrato (Figura 3). Ativadores, E2s e substratos se ligam reversivelmente ao núcleo APC com afinidades variadas e interagem entre si também. Para entender a contribuição de cada um desses componentes para a reação de ubiquitinação, é útil primeiro resumir suas características básicas.

Os quatro principais componentes proteicos em uma reação APC. A catálise depende de interações cooperativas entre o núcleo APC, ativador, substrato e E2.

Núcleo APC

O APC é um complexo de aproximadamente 1 MDa, fortemente associado de 11 a 13 subunidades que geralmente são bem conservadas em eucariotos (Figura 4 Tabela 1). A APC é uma ubiquitina-proteína ligase do tipo Cullin-RING [7], na qual as subunidades Apc2 e Apc11 contêm os domínios cullin e RING, respectivamente. Como em outras ligases Cullin-RING, o domínio RING de Apc11 interage diretamente com E2, e o domínio cullin de Apc2 se liga a Apc11 e provavelmente fornece um suporte estendido que conecta essas duas subunidades ao resto da enzima.

O núcleo APC contém vários subcomplexos. O núcleo APC de levedura de brotamento é um complexo de aproximadamente 1 MDa de 13 subunidades (Tabela 1), incluindo as nove subunidades principais mostradas aqui. Um subcomplex (verde escuro) contém a subunidade cullin Apc2 e a proteína de domínio RING Apc11, que recruta E2s. Outro subcomplex (verde claro) contém as três subunidades contendo TPR, Cdc27, Cdc23 e Cdc16, bem como duas subunidades, Apc4 e Apc5, que ajudam a conectá-los ao resto do APC via Apc1. As subunidades contendo TPR fornecem locais de ligação para o ativador (Cdh1 ou Cdc20), que contém pelo menos dois motivos de interação APC, o motivo Ile-Arg (IR) e o C-box, bem como uma grande sequência de repetição WD40 que é provável que forme um local de ligação semelhante a uma hélice para o substrato.

A análise de APC purificado a partir de cepas de levedura sem subunidades individuais levou à identificação de subcomplexos de APC (Figura 4) [8]. Um contém Apc2 e Apc11, bem como uma terceira subunidade, Doc1. Doc1 contém uma estrutura de barril β conhecida como domínio Doc, que em outras proteínas está envolvida na ligação a pequenos ligantes, e esta subunidade pode contribuir para a ligação do substrato, como discutido mais tarde. O outro subcomplexo APC contém três grandes subunidades (Cdc27, Cdc16 e Cdc23 na levedura) que carregam dez ou mais cópias de um motivo de sequência de 34 resíduos denominado repetição de tetratricopeptídeo (TPR). Essas subunidades parecem associar-se sequencialmente ao APC, de forma que a associação de Cdc27 depende de Cdc16, e a associação de Cdc16 depende de Cdc23 [8]. Os cálculos da estequiometria sugerem que as subunidades TPR estão presentes em duas cópias no APC [9, 10]. Os TPRs geralmente formam sulcos de ligação a proteínas e, portanto, as múltiplas subunidades de TPR são susceptíveis de fornecer uma grande variedade de superfícies de interação no núcleo de APC.

Os dois subcomplexos APC são mantidos juntos pela maior subunidade APC, Apc1 (Figura 4). Apc4 e Apc5 ajudam a conectar Apc1 à base do subcomplex TPR, Cdc23. As subunidades não essenciais Cdc26 e Swm1 (não mostradas na figura) ajudam a estabilizar a associação das subunidades TPR com o resto do APC [11, 12]. O Cdc26 promove a integridade do APC formando um complexo com os sulcos TPR do Cdc16 [13]. As funções de outras subunidades APC permanecem obscuras.

Várias análises de microscopia eletrônica (EM) forneceram um vislumbre do tamanho e da forma do APC [9, 10, 14-16]. Em uma resolução de cerca de 30 Å, o APC de levedura parece formar uma partícula triangular, e a localização de subunidades individuais por marcação de anticorpo é aproximadamente consistente com a arquitetura determinada a partir de estudos de subcomplexos [10, 16]. Na estrutura EM de mais alta resolução, as subunidades TPR estão localizadas em uma estrutura de 'lâmpada de arco', e Apc2 é encontrado em uma região de 'plataforma' adjacente onde E2s provavelmente se ligam [16].

Ativador

Apesar de seu grande tamanho, o núcleo APC tem pouca atividade na ausência de uma de suas proteínas ativadoras, Cdc20 ou Cdh1 (um terceiro ativador, Ama1, é expresso apenas na meiose e não será discutido aqui [17]). O Cdc20 associa-se ao APC no início da mitose, levando à destruição de alvos que controlam o início da anáfase. A ligação do Cdc20 ao APC é promovida pela fosforilação de múltiplas subunidades APC [18-23]. Mais tarde na mitose, Cdc20 é substituído por Cdh1, que mantém a atividade por meio do G1 seguinte. A associação de Cdh1 com a APC depende da desfosforilação de Cdh1 [20, 24, 25].

As proteínas ativadoras participam do reconhecimento do substrato pelo APC. As regiões carboxi-terminais de Cdc20 e Cdh1 contêm um domínio WD40 que se pensa formar uma plataforma de ligação semelhante a uma hélice que liga substratos APC [26-29]. É provável que variações de sequência nos domínios WD40 de Cdc20 e Cdh1 resultem em diferentes especificidades de substrato. Essas diferenças na especificidade fornecem um mecanismo para cronometrar a destruição de diferentes alvos APC na mitose: Cdc20 tem como alvo um pequeno número de substratos-chave para destruição na metáfase, enquanto Cdh1 possui uma especificidade mais ampla, tendo como alvo essas proteínas e muito mais na mitose tardia e G1 [ 30, 31].

Os ativadores também contêm pelo menos dois motivos de sequência, o motivo Ile-Arg (IR) e C-box, que são necessários para a ligação do ativador ao núcleo APC. O motivo IR consiste em dois resíduos no terminal carboxila do ativador, e a C-box é um motivo de oito resíduos próximo ao terminal amino [29, 32, 33]. A ligação do ativador ao APC é pelo menos parcialmente mediada pelas subunidades TPR (Figura 4): Cdh1 se liga diretamente ao Cdc27 em vitro [26, 32], e resíduos específicos nos sulcos de interação de proteína formados pelos TPRs em Cdc27 e Cdc23 são necessários para a ligação de Cdh1 e Cdc20 [34]. O motivo ativador IR liga-se aos TPRs de Cdc27, e uma região ativadora não identificada adicional parece ligar-se aos TPRs de Cdc23 [34]. O sítio de ligação da C-box permanece desconhecido, mas uma possibilidade é a subunidade Apc2, pois a remoção de Apc2 do APC reduz a ligação do ativador [8]. Juntas, essas múltiplas interações geram uma ligação de afinidade muito alta do ativador ao núcleo APC, e é provável que o ativador permaneça ligado durante vários eventos de ligação ao substrato [34]. Análises recentes de EM sugerem que o ativador é encontrado entre a lâmpada de arco TPR e Apc2, em uma posição ideal para apresentar substratos para atacar os conjugados E2-ubiquitina entrantes [16].

Substrato

Considerando que tanto o E2 quanto a proteína alvo são quimicamente alterados durante a ubiquitinação, para maior clareza usamos o termo 'substrato' para nos referirmos ao alvo ubiquitinado e não ao E2. Os dois substratos essenciais do APC são a securina e as ciclinas mitóticas (Figura 1) [35]. A degradação da securina desencadeia a separação da cromátide irmã, e a degradação das ciclinas mitóticas é necessária para a conclusão da mitose. O APC, particularmente quando ligado ao Cdh1, também ubiquitina numerosas outras proteínas envolvidas em vários aspectos da saída mitótica [5].

Os substratos ligam-se especificamente ao complexo APC-ativador por meio de sequências de degradação, as mais bem compreendidas das quais são a D-box (RXXLXXXN) e a KEN-box (KEN) [36, 37]. Embora as sequências D- e KEN-box sejam necessárias para a ubiquitinação de muitos substratos pelo APC, muitas vezes não são suficientes, sugerindo que os substratos contêm sequências de degradação não identificadas adicionais [36, 37]. Numerosos substratos de APC contêm sequências de degradação não canônicas que carecem de quaisquer semelhanças de sequência claras [38-45]. É provável que a maioria, senão todos, os substratos de APC contenham múltiplas sequências de degradação e possam, portanto, ser capazes de interações multivalentes com o complexo APC-ativador.

Seqüências de degradação e lisinas ubiquitinadas são freqüentemente encontradas em regiões de substrato que são provavelmente desordenadas. Por exemplo, o domínio de ligação a Cdk globular de ciclinas é geralmente precedido por uma região amino-terminal desordenada que contém as sequências D- e KEN-box críticas, juntamente com numerosas lisinas. É também provável que a securina possua uma região de reconhecimento de APC amino-terminal desordenada adjacente a um domínio funcional carboxi-terminal. A separação dos domínios de degradação e funcionais pode impedir que o sinal de degradação interfira com a função normal da proteína e, portanto, pode facilitar a evolução da degradação regulatória. Como sequências desdobradas nos terminais amino ou carboxila das proteínas são necessárias para seu desdobramento e translocação eficientes no poro do proteassoma para degradação [46, 47], essas regiões desdobradas podem ser uma marca registrada de todos os alvos de degradação.

E2s compartilham um domínio de núcleo conservado de aproximadamente 150 aminoácidos, incluindo o resíduo de cisteína central ao qual a ubiquitina está ligada, alguns E2s também contêm extensões de terminal amino ou carboxi que conferem especificidade às suas funções. Os E2s são carregados com ubiquitina pela enzima E1 de ativação da ubiquitina (Figura 2a). Como os E2s usam a mesma interface de ligação para interagir com os E1 e E3, os E2s devem se dissociar do E3 para serem recarregados com a ubiquitina [48]. A taxa de rotatividade de E2 é muito rápida: durante em vitro Em experimentos de ubiquitinação, o APC pode adicionar até dez ubiquitinas a um substrato em segundos (MR-B e MEM, resultados não publicados).

Ubiquitina-proteínas ligases, como a APC, catalisam duas reações distintas: a ligação de ubiquitinas a diferentes substratos de lisinas (denominada monoubiquitinação múltipla) e a transferência de ubiquitinas para lisinas específicas em ubiquitinas previamente ligadas, levando à formação de cadeias de ubiquitina (denominadas poliubiquitinação) . A especificidade da lisina é determinada principalmente pelo E2. Na levedura, por exemplo, Ubc4 promove a adição de ubiquitinas a lisinas de substrato, enquanto Ubc1 catalisa a ubiquitinação de lisina 48 (K48) de uma ubiquitina previamente ligada, levando a cadeias ligadas a K48 que são reconhecidas pelo proteassoma [49]. As diferentes preferências desses E2s permitem que eles colaborem na Vivo, de modo que Ubc4 anexa as ubiquitinas iniciais às lisinas de substrato e Ubc1 estende essas ubiquitinas em cadeias ligadas a K48. Em vertebrados, UbcH5, como seu ortólogo de levedura Ubc4, tende a gerar ligações inespecíficas às lisinas de substrato [50, 51], enquanto E2-25K, como a levedura Ubc1, gera cadeias ligadas a K48 [49, 52]. UbcH10 permite que o APC faça cadeias ligadas a K11 [51].


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Discussão

Previously, we have shown that KLHL12 interacts with the polymorphic repeats of the D4R and enhances its ubiquitination [8] but this has no influence on receptor degradation [31]. In the present study we investigated which specific residues of the D4R are ubiquitinated by the KLHL12-Cullin3 E3 ligase complex. In the whole sequence of D4R there are only four lysine residues and all of them can potentially serve as ubiquitin binding sites as they are localized in the intracellular domains of the receptor. Using a site-directed mutagenesis approach each lysine was separately mutated to arginine. Next, sequential double IP experiments demonstrated that all four mutants are ubiquitinated and overexpression of KLHL12 increases their ubiquitination level ( Fig 2 ). This suggests that ubiquitination occurs on multiple lysines or that the ubiquitination system is flexible and when the most preferred ubiquitin binding site is unavailable it can ubiquitinate another available lysine. Next, we created the quadruple mutant HA D4.2 4KRR in which all four lysines were mutated to arginines. This mutant should be unable to undergo lysine-mediated ubiquitination. Surprisingly, we could still detect basal ubiquitination of this mutated receptor and upon co-expression of KLHL12 an increase in its ubiquitination was visualized ( Fig 3 ). This finding encouraged us to search for other possible ubiquitination sites in the D4R. Ubiquitination on non-lysine residues is still a poorly studied phenomenon and until now ubiquitination on the N-terminus [11�, 40], cysteine [14�], serine and threonine [17�] residues was described, but it has only been suggested once for a GPCR unfortunately without characterizing the precise amino acid residue [32]. In our study we investigated the possibility of ubiquitin binding to cysteine, serine and threonine residues within the intracellular domains of the D4R. One of the most common approaches to verify ubiquitination on a non-lysine residue is a chemical cleavage of ubiquitin [38]. Ubiquitin attached to a lysine residue forms an isopeptide bond which is very stable, whereas a thioester bond connecting ubiquitin with cysteine can be destroyed during treatment with a highly reducing agent e.g. a high concentration of DTT [15, 16, 36]. Our results clearly indicate that upon treatment with a very high concentration of DTT the ubiquitination signal detected after the second IP is significantly reduced for both WT D4.2R and D4.2 4KRR, suggesting ubiquitination on cysteine residues ( Fig 4 ).

Next, we examined the possibility of ubiquitination on serine and/or threonine residues. When ubiquitin is attached to a serine or threonine residue an oxyester bond is formed which is susceptible for cleavage in a strong alkaline environment [36, 37]. We have performed a ubiquitination assay in which, after the first IP, the samples were treated with NaOH and after the second IP a strong decrease in ubiquitination signal was observed ( Fig 5A ). These results thus suggest that D4R ubiquitination on cysteine, serine and/or threonine residues can be promoted by KLHL12. It is, however, not possible to say which residues are the most preferred for KLHL12-induced ubiquitination as quantification of the results from multiple independent experiments indicates a comparable decrease in ubiquitination levels for both types of treatments ( Fig 5B� ). The decrease is more explicit when Etag KLHL12 is co-expressed which suggests that during KLHL12-promoted ubiquitination more non-lysine residues in the D4R are ubiquitinated compared to the basally ubiquitinated receptor. This decrease is even more striking in case of the D4.2 4KRR mutant in which no lysine residues are available. This indicates that in the WT receptor KLHL12 promotes ubiquitination on lysine and non-lysine residues and in the D4.2 4KRR mutant, in which lysines are not available, only non-lysine residues are ubiquitinated. The fact that in all experiments we detect an overall lower ubiquitination signal from D4.2 4KRR ( Fig 5F ) compared to WT D4.2R further supports the hypothesis about the involvement of lysine residues in KLHL12-mediated ubiquitination of D4R. To exclude the possibility that the alkaline treatment affects amide bonds which are normally formed between ubiquitin and lysine residues we have also checked the influence of NaOH on ubiquitination of other GPCRs for which lysines were described as ubiquitin binding sites. We have used the CXCR4 receptor for which three lysines in the C-terminal tail were shown to be critical for receptor ubiquitination [26]. As a second receptor we used the β2AR for which lysines in the third intracellular loop and in the C-terminal tail were presented to be important for ubiquitination and subsequent lysosomal degradation [28]. In this control experiment (S3 Fig), we have seen again a very strong effect of NaOH treatment on basal and KLHL12-induced ubiquitination of D4.2R and no effect on CXCR4 and β2AR ubiquitination. This result allows us to conclude that the conditions used for alkaline treatment are not affecting amide bonds which are formed during the typical lysine-linked ubiquitination process. Most papers that study ubiquitination on non-lysine residues identified several different residues as possible ubiquitination sites. Some of them are most preferred by the ubiquitination machinery but when those are not available ubiquitin can bind to other amino acids. Such situation was described for example for NS-1 nonsecreted immunoglobulin light chain (NS-1 LC) which is predominantly ubiquitinated on serine/threonine residues but when these amino acids were mutated then lysine residues could serve as ubiquitin-binding sites. Mutation of all three types of amino acids (serines, threonines and lysines) was required to efficiently reduce ubiquitination and stabilize the NS-1 LC [37]. Another example represents the T-cell antigen receptor α-chain (TCRα) for which mutation of two conserved serine residues to alanines in the cytosolic tail inhibited significantly receptor ubiquitination. However, when serine residues were replaced with lysine, cysteine or threonine residues the protein was still ubiquitinated [17]. Our findings seem to be in agreement with this previously described phenomenon showing that the ubiquitination machinery is a very flexible system and can easily change from one to another ubiquitination site if necessary.

To obtain a direct proof of ubiquitination on a non-lysine residue we decided to perform mass spectrometry (MS) analysis. Detection of ubiquitination by MS is possible due to the di-glycine remnant that remains attached to the ubiquitinated residue after tryptic digestion [41]. We have performed MS/MS analysis using a Fourier transform mass spectrometer but no ubiquitination was detected. Unfortunately, during tryptic digestion D4R is cut to single amino acid or very large fragments making it very hard to analyze. The computational prediction of cleavage of D4R with other enzymes, commonly used to prepare samples for MS analysis, did not suggest any good alternative to trypsine that could resolve this problem. According to our knowledge non-conventional ubiquitination was never proved with MS analysis probably due to the labile nature of thio-/oxy-ester bonds which are formed between ubiquitin and non-lysine residues. So far, only one study described the use of a novel peptide-based SILAC method to identify non-conventional ubiquitination of T-cell receptor α [42]. The authors could identify modified peptide which did not contain lysine in its sequence, however, they were unable to pinpoint the specific residue that undergoes ubiquitination.

Therefore, it is not very surprising that the detection of ubiquitination of D4R with MS/MS was not successful.

However, and most importantly, all the obtained data allow us to conclude that KLHL12 can promote ubiquitination of D4R on non-lysine residues and that ubiquitination on cysteine, serine and/or threonine is possible. The functional role of this non-lysine ubiquitination is hard to study because it would require the creation of a receptor with all possible ubiquitination sites mutated. Mutation of all intracellular cysteines, serines and threonines increases the chances of disrupted protein folding and it can also interfere with other posttranslational modifications. GPCRs are tightly regulated by phosphorylation which mainly occurs on serine and threonine residues and also by palmitoylation on cysteine residues (conserved cysteines located on the C-terminus of many GPCR) and also D4R shows these posttranslational modifications. Additionally, this can also inhibit binding of some interacting proteins, e.g. β-arrestins for which often phosphorylation of the receptor is required and which also play a critical role in the regulation of GPCR signaling. Therefore, mutation of all of these residues increases the possibility of creating of a mutant with completely different signaling properties compared to the wild type receptor. In most of the examples of non-lysine ubiquitination, which were described up to now, this modification seems to serve as a signal for protein degradation [14, 17�, 21]. Only in the case of Pex5p receptor (cytosolic receptor for peroxisome matrix proteins) ubiquitination of conserved cysteine 11 was shown to be involved in regulation of the recycling of the receptor form the peroxisomes to cytosol [15]. To the best of our knowledge, ubiquitination of the non-lysine residue was suggested only once for a GPCR. The group of Shenoy has shown that β2AR is probably ubiquitinated on a non-lysine residue in response to the treatment with an antagonist, carvedilol, as they could still detect ubiquitination of the β2AR in which lysines were mutated. Interestingly, the same mutant was not ubiquitinated upon agonist, isoproterenol, treatment. Carvedilol-promoted ubiquitination is mediated by a completely different E3 ubiquitin ligase which is not involved in the, already well defined, lysine-mediated ubiquitination of β2AR. However, both types of ubiquitination lead to endocytosis and lysosomal sorting of the receptor [32].

In the second part of our study we investigated the ubiquitination status of the three most common D4R polymorphic variants. First, the interaction of KLHL12 with these variants was examined. After IP of HA-tagged receptors co-precipitation of Etag KLHL12 with D4.2R, D4.4R and D4.7R was detected ( Fig 6 ). As a negative control we used D4.0R which is an artificial receptor variant lacking the polymorphic repeats. Next, a double sequential IP was performed to investigate the ubiquitination status of the different polymorphic variants. Ubiquitination of D4.2R and D4.4R was clearly increased when Etag KLHL12 was co-expressed, but surprisingly we hardly observed increased D4.7R ubiquitination ( Fig 7A and 7B ), although this receptor variant is still able to form a complex with KLHL12 and Cullin3 ( Fig 8 ). The differential ubiquitination pattern of the D4.7R, compared to the other D4R variants, is highly interesting as until now there is hardly evidence for pharmacological differences between this variant and the other receptor variants [43�], although behavioral research showed that the D4.7R is linked with a predisposition to develop ADHD [6], and also its association with increased sexual behavior, alcohol and cigarette craving was suggested. The functional role of differential KLHL12-mediated ubiquitination of the D4R is still under investigation. This finding opens a lot of new questions for future research on the possible role of ubiquitination in receptor signaling and suggests that ubiquitination can regulate GPCRs in a much more complicated way than previously expected.


Resumo

Ubiquitin (Ub)-conjugating enzymes (E2s) and ubiquitin ligases (E3s) catalyze the attachment of Ub to lysine residues in substrates and Ub during monoubiquitination and polyubiquitination. Lysine selection is important for the generation of diverse substrate-Ub structures, which provides versatility to this pathway in the targeting of proteins to different fates. The mechanisms of lysine selection remain poorly understood, with previous studies suggesting that the ubiquitination site(s) is selected by the E2/E3-mediated positioning of a lysine(s) toward the E2/E3 active site. By studying the polyubiquitination of Sic1 by the E2 protein Cdc34 and the RING E3 Skp1/Cul1/F-box (SCF) protein, we now demonstrate that in addition to E2/E3-mediated positioning, proximal amino acids surrounding the lysine residues in Sic1 and Ub are critical for ubiquitination. This mechanism is linked to key residues composing the catalytic core of Cdc34 and independent of SCF. Changes to these core residues altered the lysine preference of Cdc34 and specified whether this enzyme monoubiquitinated or polyubiquitinated Sic1. These new findings indicate that compatibility between amino acids surrounding acceptor lysine residues and key amino acids in the catalytic core of ubiquitin-conjugating enzymes is an important mechanism for lysine selection during ubiquitination.

Protein ubiquitination plays a fundamental role in most cellular processes and involves three classes of enzymes (22). First, the 8-kDa protein ubiquitin (Ub) forms a thioester bond with the E1 Ub-activating enzyme. Ub is then transferred from E1 to the active-site cysteine of E2. Finally, E2s in conjunction with an E3 transfer Ub to a substrate lysine to form an isopeptide bond. E3 ligases are important for substrate recognition, and two major families exist. The RING (really interesting new gene) finger E3s, which lack catalytic activity, recruit the substrate and E2 into one complex to facilitate ubiquitination (19). Catalytic HECT (homologous to E6-AP carboxyl terminus) E3s accept Ub from E2 via a catalytic cysteine and then transfer Ub to a substrate lysine (22). The versatility of Ub in regulating different processes derives from its ability to be conjugated as a monomer (monoubiquitination) or polymer (polyubiquitination) to substrate lysines. Since Ub contains seven lysines, polyubiquitination can generate chains with different topologies (18). Monoubiquitination can regulate DNA repair, viral budding, trafficking, and gene expression (17). Polyubiquitination through Ub K11, K29, or K48 results in proteasomal degradation, while K63-linked Ub chains function in kinase activation, DNA damage tolerance, signal transduction, and endocytosis (17). In RING E3s the mode of ubiquitination (mono- or polymeric) and Ub linkage specificity are determined by E2, while HECT E3s specify the mode of ubiquitination with this family (11, 12).

The mechanisms that control mono- or polyubiquitination, chain topology, and lysine selection are poorly understood. Insights into this area have come from studies of the RING E3 ligase Skp1-Cdc53/cullin F-box (SCF) protein and its cognate E2, Cdc34, (19). One critical substrate of the budding yeast SCF Cdc4 /Cdc34 complex (superscript indicates the F-box protein) is Sic1. Sic1 is an inhibitor of the cyclin-dependent kinase (CDK) Cdc28 (29), containing a CDK-inhibitory domain within its C-terminal 70 amino acids (9). No Saccharomyces cerevisiae, G1-S-phase cell cycle progression depends on the SCF Cdc4 /Cdc34-mediated polyubiquitination of Sic1 on at least one of the six N-terminal lysine residues (K32, K36, K50, K53, K84, and K88) via K48-linked Ub chains, leading to its proteasomal degradation (9, 20). A Sic1 mutant missing these six lysines is still ubiquitinated on the remaining 14 lysines em vitro but is not degraded and is stable na Vivo, leading to cell cycle arrest (20).

While a Ub chain on any one of six Sic1 N-terminal lysines sustains proteolysis, the turnover rates vary by 5-fold between the K36 and K84 sites, indicating that the context of the Ub chain is important (20). How SCF Cdc4 /Cdc34 ubiquitinates different Sic1 lysines and whether a lysine preference exists are poorly understood, but a “positioning model” has been proposed, where E3 positions substrate lysines favorably for the attack of the E2∼Ub thioester bond (19, 37). Previous studies suggested that the number of substrate ubiquitination sites correlates with the number of its F-box protein binding sites (8, 33, 37). For example, the ubiquitination of β-catenin and I㮫α is directed by a single high-affinity F-box protein binding site, and changes to the distance between the binding site and the lysine affect catalysis by 𢏂-fold (37). The phosphorylation of Sic1 on multiple CDK sites at the N terminus generates several low-affinity Cdc4 binding sites that dynamically bind Sic1 to the single site of Cdc4 in various geometries, leading to ubiquitination on numerous lysines. The directed binding of Sic1 to Cdc4 through a single artificial high-affinity binding site at the extreme N terminus confines efficient ubiquitination to lysines K84 and K88 (33). Sic1 lysine selection flexibility may also be achieved by the dimerization of the RING E3/E2 complex (8, 33). In addition, the neddylation of the cullin subunit induces conformational variation to the E2, enhances the recruitment of E2 to SCF, and brings substrate lysines toward the Cdc34∼Ub thioester to accommodate the ubiquitination of different lysines (6, 25). Lysine selection flexibility may also be achieved by the release of the ubiquitin-charged Cdc34∼Ub from SCF to transfer Ub to different substrate lysines, as proposed by the “hit-and-run” hypothesis (5). Apart from higher-order structures contributing to lysine selection flexibility, studies with the human anaphase-promoting complex (APC/C) RING E3 and its E2, UbcH10, have identified a sequence motif adjacent to acceptor lysines, termed the TEK box, which is important for lysine selection (11).

Similar to the E3-mediated positioning of substrate lysines, structural aspects of E2s position Ub lysines to generate Ub chains of different topologies by RING E3/E2 complexes (11, 12). Structural studies of Mms2/Ubc13-Ub demonstrate that this complex assembles so that K63 of Ub is positioned proximal to the Ubc13-Ub thioester bond during Ub chain formation (35). Similarly, Cdc34 dimerization, a noncovalent Ub binding domain (UBD), and structural constraints such as an acidic loop region were suggested previously to position K48 of Ub for the attack of the Cdc34∼Ub thioester bond (21, 36). However, E2s such as human UbcH5 utilize all Ub lysines but display a preference for K11, K48, and K63, indicating less structural constraint and that other mechanisms contribute to Ub lysine preference (12).

To further elucidate the mechanisms of lysine specificity, we assessed the SCF Cdc4 /Cdc34-mediated ubiquitination of Sic1's N-terminal lysines and K48 in Ub. SCF Cdc4 /Cdc34 displayed a strong preference for Sic1 K53. Changes to proximal amino acids regulated the rate of ubiquitination in Sic1 and K48 of Ub. This was linked to key residues composing the catalytic core of Cdc34. The mutation of these core sites differentially affected Cdc34 preference toward lysines on Sic1 or Ub K48. Our studies demonstrate that in addition to the importance of the SCF/Cdc34-mediated positioning of lysines, efficient catalysis is dependent on residues surrounding ubiquitinated lysines and their compatibility with the Cdc34 catalytic core residues. We propose that this compatibility is an important mechanism for lysine selectivity during ubiquitination.


Ubiquitin Specific Peptidase 16

Normal Function and Disease Involvement

Histone ubiquitination occurs primarily on histone H2A and H2B with ubiquitination levels between 5–15% and 0.1–1% for histone H2A and H2B respectively [29,30] . Histone H2A is ubiquitinated by Polycomb Repressive Complex 1 catalytic subunit Ring1b [31–33] . H2A ubiquitination is strongly associated with gene repression. Usp16 opposes the activity of Ring1b by removing ubiquitin from H2A lysine 119 [10] . Histone H2A deubiquitination has been shown to play pivotal roles in cell cycle progression, gene expression and DNA damage response [5,10,11] .

Early work demonstrated a requirement for Usp16 deubiquitinase activity during mitosis. A catalytically inactive Usp16 mutant was found to coat mitotic chromosomes and block cell cycle progression [5] . Subsequently, it was discovered that Usp16 H2A deubiquitination is required for the Aurora B catalyzed Ser-10 phosphorylation of H3 [10] . The phosphorylation status of Usp16 changes sequentially during cell cycle progression, possibly through the activity of cdc-2/cyclin B [5] . Although changes in phosphorylation state have not been associated with altered deubiquitinase activity em vitro, the phosphorylation state of Usp16 may control its cellular localization, oligomerization state, or may serve as a docking site for associating proteins.

Characterizations of the H2A ubiquitin ligase Ring1b established the importance of H2A ubiquitination for Hox gene repression and X chromosome inactivation [31–33] . Usp16 mediated H2A deubiquitination is required for Hox gene expression [10] . Developmental studies in X. laevis demonstrate that Usp16 catalyzed H2A deubiquitination of Hox genes is required for proper Hox gene expression and posterior body patterning [10] .

Recapitulating its role in gene expression, Usp16 also reverses the ubiquitin H2A stimulated transcriptional repression that occurs during DNA damage response [11] . Following DNA damage, H2A is rapidly ubiquitinated for several hundred kilobases from the site of damage. The ubiquitination of H2A following DNA damage is associated with transcriptional silencing and is required for the recruitment of DNA damage repair proteins [34,35] . Usp16 participates in the restoration of normal gene expression following damage repair by deubiquitinating H2A [11] .

Recent characterization of the genome and epigenome of human breast tumors and leukemias has revealed that Usp16 is consistently downregulated in cancer cells. In addition to the genetic changes which initiate cancer, general epigenetic misregulation is common in tumors, including epigenetic silencing of tumor suppressors and activation of oncogenes. It is theorized that Usp16 downregulation could be associated with stable gene silencing following DNA damage [11] . Alternatively, Usp16 downregulation may influence global gene expression levels. Additionally, genetic inversions involving Usp16 and RUNX1 (a key regulator of hematopoiesis) have been observed in chronic myelomonocytic leukemias. The inversion results in the partial deletion of Usp16 and Runx1 and the creation of a new Usp16-Runx1 fusion protein [36] . The pathogenic potential of Usp16 downregulation and deletions has not been thoroughly explored.


Resumo

Endocytosis and targeting of growth factor receptors for lysosomal degradation have been associated with ubiquitination of the intracellular part of the receptors. To elucidate the role of receptor ubiquitination in internalization and sorting of fibroblast growth factor receptor (FGFR), we constructed several mutants of FGFR1 in which lysines, potential ubiquitination sites, were substituted for arginines. Substitution of all lysine residues in the intracellular part of FGFR1 resulted in inactivation of the tyrosine kinase domain of the receptor. However, several multilysine FGFR1 mutants, where up to 26 of 29 lysines in the intracellular part of the receptor were mutated, retained tyrosine kinase activity. The active multilysine mutants were poorly ubiquitinated, but internalized normally, indicating that ubiquitination of the receptor is not required for endocytosis. In contrast, degradation of the multilysine mutants was dramatically reduced as the mutants were inefficiently transported to lysosomes but rather sorted to recycling endosomes. The altered sorting resulted in sustained signaling. The duration of FGFR1 signaling seems to be tightly regulated by receptor ubiquitination and subsequent sorting to the lysosomes for degradation.


Additional Information

Códigos de acesso: Coordinates and structure factors have been deposited in the RCSB protein data bank (PDB) under accession codes: 5KTY (hMiro1-BC_Ca 2+ ), 5KU1 (hMiro1-BC_GDP), 5KSZ (hMiro1-BC_GMPPCP), 5KSP (hMiro1-C C2221), 5KSY (hMiro1-C P41212), 5KSO (hMiro1-C P3121), 5KUT (hMiro2-C).

How to cite this article: Klosowiak, J. L. et al. Structural insights into Parkin substrate lysine targeting from minimal Miro substrates. Sci. Representante. 6, 33019 doi: 10.1038/srep33019 (2016).


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