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Todas as isoformas de microRNA precisam ser conhecidas e sequenciadas para obter a expressão de microRNA?

Todas as isoformas de microRNA precisam ser conhecidas e sequenciadas para obter a expressão de microRNA?


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Pelo que entendi, microRNA são estruturas nc curtas em forma de "grampo de cabelo". Ao sequenciar e contar miRNA, miRNA isoforma são "encontrados", que são subseções de comprimento variável e, possivelmente, com algumas mutações ou outras diferenças para o microRNA "canônico". As contagens totais para um miRNA são as somas das contagens das isoformas relacionadas a esse miRNA. [Corrija-me se tudo estiver errado]

Com relação ao sequenciamento de próxima geração, uma 'biblioteca' precisa ser adicionada, informando o que sequenciar. Isso significa que apenas isoformas "conhecidas" podem ser lidas e contadas ou podem ser lidas e contadas "novas" sequências (isto é, mutações) que não eram conhecidas antes do início do sequenciamento?

Com relação ao qPCR - esta técnica procura apenas isoformas individuais? Nesse caso, se eu quiser saber algo sobre uma expressão de microRNA em particular, eu precisaria fazer qPCR para cada isoforma conhecida relacionada a esse microRNA. OR, é de fato mais fácil sequenciar a expressão de microRNA com qPCR, uma vez que as sequências podem ser combinadas com a estrutura em grampo principal com maior probabilidade. (Por mais fácil Quer dizer, em comparação com o desejo de obter a expressão para uma isoforma específica, uma vez que ela precisa ser correspondida exatamente).


Eu havia trabalhado em um problema semelhante e estou contando minha experiência.

Primeiro, você deve considerar o fato de que um miRNA maduro pode surgir de vários locais genômicos, ou seja, muitos pré-miRNAs podem dar origem ao mesmo miRNA maduro.

Como você disse, existem produtos de clivagem de pré-miRNA com heterogeneidade em suas extremidades, ou seja, existem sequências que não correspondem exatamente à região madura anotada. Enquanto os produtos com heterogeneidade 3 'podem ser chamados de isoformas, os produtos com heterogeneidade 5' provavelmente têm alvos diferentes conforme a sequência da semente é interrompida e, portanto, são miRNAs tecnicamente diferentes (por definição).

Agora, a melhor técnica para analisar isoformas é o sequenciamento de RNA pequeno (NGS). qPCR não seria uma boa técnica, pois os primers nem sempre podem diferenciar sequências altamente semelhantes (piorado pelo fato de que os miRNAs são muito pequenos). Uma biblioteca NGS é um conjunto de sequências de DNA que você obtém ao cortar o RNA / DNA seguido por uma ligação adaptadora (transcrição reversa para RNA). Como a sequência do adaptador é conhecida, a reação de sequenciamento não exige que você conheça a sequência dos produtos. No entanto, você precisa saber o genoma de referência para encontrar novos miRNAs. Isso se deve principalmente ao fato de que é muito difícil sequenciar pré-miRNAs (baixa abundância e estrutura em grampo). Você pode identificar novos pequenos RNAs com muita facilidade, mas não pode dizer que eles são miRNAs, a menos que você possa mapeá-los para um precursor de haste-alça (pré-miRNA).

Você pode muito bem descobrir novas leituras e as pessoas descobriram muitos novos miRNAs usando NGS. Posso contar a metodologia que segui para encontrar produtos atípicos do mesmo pré-miRNA. Para simplificar, chamo os produtos 5 'heterogêneos de sementes ruins (porque eles interromperam a sequência de sementes) e produtos heterogêneos 3 'como isomiRs. Usei uma metodologia semelhante à de um programa bem conhecido - miRdeep.

  1. Obtenha as sequências de pré-miRNA de miRbase
  2. Obtenha sequências de miRNA maduras de miRbase
  3. Use o bowtie-1 para construir um índice a partir das sequências pré-miRNA
  4. Remova o adaptador de suas leituras fastq e remova as leituras de baixa qualidade. Existem muitas ferramentas para fazer isso. Você pode experimentar o Trimmomatic.
  5. Mapeie as sequências de miRNA maduras para o índice de pré-miRNA usando o bowtie para encontrar a localização exata do miRNA maduro no pré-miRNA
  6. O mapa lê para a região pré-miRNA. Filtre as leituras que não mapeiam em uma janela predefinida em torno da região madura.
  7. Classifique as leituras como semente de mácula ou isomiR

Agora, isomiRs e lê esse mapa perfeitamente para a região de miRNA madura podem ser considerados como contribuintes para a expressão total de miRNA. Contudo, sementes ruins não deve ser considerado uma isoforma. Você também pode permitir um certo nível de incompatibilidade e contar essas leituras. Sequências com incompatibilidade na região de semente seriam novamente sementes ruins. Além disso, você pode ter esquemas de pontuação para suas leituras.

Não existem muitos estudos sobre tal análise. Não obtive nenhum resultado publicável com nossos dados, mas a metodologia está razoavelmente correta. Você pode ir em frente e aplicá-lo em seu estudo.


Até agora, não houve nenhum controle positivo de miRNA conhecido com efeitos funcionais robustos e confirmados na expressão gênica em células de mamíferos em cultura. Para atender a essa necessidade, os cientistas da Ambion desenvolveram um Precursor de miRNA Pré-miR hsa-miR-1, um oligonucleotídeo de RNA de fita dupla, que pode ser usado como um controle positivo em experimentos junto com outros precursores de miRNA Pré-miR.

Pré-miR hsa-miR-1 miRNA Precursor, que imita miR-1 maduro, foi mostrado para regular para baixo o gene da proteína tirosina quinase 9 (PTK9 twinfillin) no nível de mRNA [1]. A expressão do mRNA PTK9 é diminuída em 60-95% após a transfecção do precursor pré-miR hsa-miR-1 miRNA, em comparação com a transfecção com o controle pré-miRNA pré-miRNA pré-negativo # 1, usando PCR em tempo real e Ensaios de expressão gênica TaqMan® [Dados de ID do ensaio # s Hs00702289_s1 (humano) e Mm01598980_g1 (camundongo) não mostrados]. Portanto, pré-miR hsa-miR-1 miRNA fornece um controle positivo conveniente para o silenciamento gênico de PTK9 mediado por miRNA, quando monitorado usando os Ensaios de Expressão Gênica TaqMan apropriados e PCR em tempo real. O controle positivo Pré-miR pode ser usado para confirmar que o procedimento de transfecção em culturas de células suporta silenciamento de gene mediado por miRNA.


Fundo

MicroRNAs são pequenos RNAs endógenos de fita simples, com aproximadamente 22 nucleotídeos de comprimento, que estão envolvidos na regulação gênica pós-transcricional em uma ampla variedade de espécies [1-4]. Os miRNAs funcionam como um componente de um complexo de silenciamento induzido por RNA (RISC), guiando-o para alvos específicos por meio da interação de emparelhamento de base entre a região de semente do miRNA e uma sequência complementar na 3'-UTR de um transcrito alvo [5,6] . Em humanos e outros animais, a região da semente normalmente se estende da segunda à oitava posições do miRNA maduro [7].

Todos os miRNAs conhecidos se originam de um precursor de RNA de fita simples em forma de estrutura de loop em gancho [8,9]. Em animais, o grampo de cabelo é excisado de um precursor mais longo por Drosha e posteriormente cortado por Dicer, que produz um duplex de RNA com extremidades salientes 3 ', cada 2 nucleotídeos de comprimento [8,10-13]. Esta estrutura duplex é compartilhada entre miRNA e pequenas vias de processamento de RNA de interferência (siRNA) [14,15]. Tanto para miRNAs quanto para siRNAs, uma das fitas duplex é então incorporada ao RISC e a outra eliminada. Uma vez que a fita selecionada determina a especificidade funcional de um RISC, esta é uma etapa crucial na via de interferência de RNA (RNAi).

Normalmente, as duas fitas são incorporadas a um RISC com diferentes probabilidades [16]. Em siRNAs, a probabilidade de seleção de fita depende da estabilidade termodinâmica relativa das extremidades do duplex precursor: uma fita com estabilidade duplex inferior na extremidade 5 'é preferencialmente selecionada [14,16]. Uma única incompatibilidade dentro dos primeiros quatro nucleotídeos de um duplex de siRNA é suficiente para determinar a especificidade de seleção de fita. Além disso, uma única substituição de nucleotídeo na extremidade 5 'de um siRNA que altera a assimetria termodinâmica de um duplex é suficiente para revertê-la completamente [14]. Em moscas, a assimetria termodinâmica do duplex de siRNA é reconhecida pela ligação preferencial do heterodímero de proteína Dcr-2 / R2D2 à sua extremidade mais estável, promovendo assim o carregamento da fita assimétrica no complexo Ago2-RISC ([17]. É importante, no entanto, a maioria dos miRNAs de mosca são carregados em um complexo de silenciamento diferente, Ago1-RISC, por um mecanismo desconhecido independente de Dcr-2 / R2D2 [18]. Assim, os determinantes de seleção de fita usados ​​nas vias de miRNA e siRNA de mosca podem ser diferentes.

Análise de sequência de 16 mosca (Drosophila melanogaster), 96 worm (Caenorhabditis elegans), 73 de camundongo e 87 miRNAs humanos mostraram que seus precursores de miRNA exibem um viés de estabilidade termodinâmica semelhante ao dos siRNAs, ou seja, a fita com a extremidade 5 'menos estável é preferencialmente representada [16]. Com base nesta observação, foi proposto que miRNAs e siRNAs podem compartilhar os mesmos determinantes de seleção de fita [16]. Análises recentes dos perfis de expressão de miRNAs humanos e de camundongo, entretanto, mostraram que os níveis de expressão relativa das duas fitas variam amplamente entre os tecidos [19]. Notavelmente, em alguns tecidos testados, miRNAs originários de uma fita termodinamicamente desfavorável estão presentes em níveis comparáveis ​​ou maiores do que seus correspondentes termodinamicamente favoráveis.

Neste estudo, determinamos os elementos de sequência associados à seleção e / ou rejeição de fita de miRNA preferencial, analisando a composição da sequência e os níveis de expressão relativa de pares de miRNA originários de duas fitas do mesmo duplex precursor em dados de sequenciamento de alto rendimento de humanos e moscas.


Discussão

Muitas evidências indicam que PKM1 é expresso em tecidos diferenciados normais, enquanto PKM2 é expresso em células em proliferação e cancerosas 18, 21. No entanto, existem poucos dados que demonstram sistematicamente a expressão de isoformas de PKM em tecidos normais. Usando espectrometria de massa, Bluemlein et al. relataram que PKM2 em vez de PKM1 é expresso preferencialmente em muitos tecidos diferenciados normais 22. Além disso, usando conjuntos de dados TCGA RNA-Seq, Desai et al. reportou que PKM2 é encontrada predominantemente em tecidos normais, exceto músculo e cérebro 23. Em nosso estudo sistemático usando 19 tipos de tecidos normais de diferentes órgãos, apenas cérebro, músculo esquelético e coração expressos principalmente PKM1 ao invés de PKM2. Essas descobertas também foram confirmadas pelo perfil de expressão de proteína encontrado em amostras de tecido de camundongo. Nossos resultados foram, portanto, semelhantes aos relatados por Bluemlein et al e Desai et al. Esses órgãos dominantes de PKM1, como cérebro e músculo, exigem alta energia para realizar suas funções, ou seja, expressam principalmente PKM1 para uso no ciclo de TCA e, assim, ganham energia de forma eficiente. Além disso, esses órgãos dominantes de PKM1 têm mecanismo para a mudança de PKM1 para PKM2 durante o desenvolvimento do câncer. Esses são casos bastante especiais. Por outro lado, os órgãos nos quais os tecidos apresentam ciclo celular curto, como o trato gastrointestinal 37, expressam principalmente PKM2 em vez de PKM1, mesmo em tecidos normais. IHC de tecido colorretal normal mostrou que a expressão de PKM1 foi dominante na camada muscular, músculo liso vascular e plexo de Auerbach. No entanto, PKM2 dominou as células epiteliais, que são a origem do desenvolvimento do câncer (dados não mostrados), o que reflete os resultados da expressão de PKM2 em amostras de tumor dos pacientes. No estudo atual, demonstramos que esses órgãos dominantes de PKM2 sofreram elevação adicional de seus PKM2 / PKM1 proporção durante o desenvolvimento do câncer por análises bioquímicas e histoquímicas (Fig. 4).

Embora já tenha sido provado que a troca de PKM durante o desenvolvimento do câncer ocorre apenas em casos especiais, o mecanismo que regula a expressão de PKM permaneceu amplamente desconhecido. Além disso, no nível de uma única célula, a troca de isoformas de PKM ainda não foi observada. Desai et al. relataram que a expressão de PKM2 se correlaciona com o estado de hipometilação do intron1 do gene 23 de PKM, mas essa correlação não é específica da isoforma no nível de transcrição. Anteriormente, foi relatado que as proteínas hnRNP incluindo PTB1 regulam a expressão de PKM 21. A PTB1 se liga repressivamente ao exon 9 que flanqueia a região no gene PKM, resultando na inclusão do exon 10 no mRNA e na regulação positiva da expressão de PKM2 em células cancerosas 6, 7. Anteriormente, descobrimos que o miR-124 induzia autofagia em células de câncer de cólon (dados não mostrados). Portanto, consideramos que o miR-124 pode regular moléculas correlacionadas com o metabolismo energético e, finalmente, descobrimos que o miR-124 tem como alvo principal o PTB1. As distribuições de tecido do miR-124 eram preferencialmente altas no cérebro, músculo esquelético e coração, mas bastante baixas no trato gastrointestinal, como estômago e cólon. Portanto, formulamos a hipótese de que miRNAs como miR-124 contribuíram para o ajuste fino da expressão de PKM1 e PKM2 ao regular o splicer PTB1 de PKM. Além disso, descobrimos que os miRNAs que têm como alvo PTB1 consistiam em miRNAs específicos do músculo, como miR-1 e miR-133 ou miRNAs específicos do cérebro, como miR-9, miR-124 e miR-137. Foi demonstrado que os miRNAs regulam as respostas fisiológicas e, portanto, esta maquinaria que regula a expressão de PKM por PTB1Os miRNAs associados podem ser considerados biologicamente significativos na carcinogênese. Além disso, é muito razoável que estes PTB1miRNAs associados seriam regulados negativamente e que esta regulação negativa estaria correlacionada com a troca de PKM1 para PKM2, elevando ainda mais a razão PKM2 / PKM1 durante o desenvolvimento do tumor.

Nossos resultados sugerem fortemente que PTB1miRNAs associados e PTB1 podem ser moléculas-alvo potenciais para o desenvolvimento de novos medicamentos anticâncer ou marcadores terapêuticos ou de diagnóstico em um futuro próximo.


Discussão

A edição de RNA A-I é amplamente difundida em transcriptomas humanos e influencia várias camadas de regulação gênica [3, 46]. Estudos recentes usaram dados de seq de RNA em escala populacional para pesquisar a variação genética da edição de RNA em tipos de células ou tecidos selecionados [27, 47, 48]. Neste trabalho, usando dados genéticos e transcriptômicos combinados em 49 tecidos em 437 indivíduos humanos, buscamos delinear a paisagem abrangente e investigar a especificidade do tecido de eventos de edição de RNA geneticamente regulados. Usando duas abordagens analíticas complementares, identificamos 3117 locais de edição de RNA edQTL e 1986 locais de edição de RNA específicos para alelos em 49 tecidos humanos, incluindo 756 locais que foram identificados por ambas as abordagens. Também descobrimos que os sinais edQTL de locais de edição de RNA específicos podem variar entre os tecidos. Por exemplo, encontramos um conjunto de locais edQTL específicos de tecido, cuja variação nos tamanhos de efeito de edQTL entre os tecidos está correlacionada com o nível de expressão de ADARB1 (Fig. 3f, Arquivo adicional 5: Tabela S4). Também observamos sinais de edQTL geralmente mais fracos no músculo esquelético, consistentes com o baixo nível de expressão de ADAR neste tecido [49]. Essas variações específicas de tecido nos sinais de edQTL podem ser atribuídas a diferenças nos níveis de edição de RNA de linha de base, dependendo das concentrações de enzimas de edição de RNA (ADAR ou ADARB1) em um determinado tecido. Compilamos nossos resultados em um servidor da web fácil de usar para os leitores explorarem os dados (https://xingshiny.research.chop.edu/edqtl/).

A análise de colocalização tornou-se uma abordagem amplamente usada para encontrar associações entre características moleculares e / ou fenotípicas, comparando a sobreposição entre seus sinais de associação [30, 32]. Encontramos 443 locais edQTL para os quais os sinais edQTL colocalizam com os sinais eQTL de seus respectivos genes em pelo menos um tecido. Devemos notar que a análise de colocalização não é baseada na distância genômica entre dois sinais QTL (por exemplo, edQTL e eQTL). Em vez disso, dados dois traços de interesse (nível de edição de RNA e nível de expressão de gene), a análise de colocalização examina e compara a distribuição geral de associação p valores para todos os SNPs em uma grande janela genômica. Intuitivamente, uma alta probabilidade posterior de co-localização é alcançada se os dois conjuntos de p as distribuições de valores acompanham umas às outras. Destacamos FADS1 como um exemplo de um sinal edQTL que colocaliza com seu sinal eQTL, bem como vários traços GWAS (Fig. 5a, b). Através da análise diferencial de edição de RNA de conjuntos de dados de RNA-seq de perturbação de miRNA, fomos capazes de ligar miRNAs com transcritos alvo em potencial de uma maneira específica de edição. Por exemplo, identificamos a transcrição editada de TYK2 como um alvo potencial de miR-138-5p. TYK2 está envolvido na via de sinalização JAK-STAT e desempenha um papel crítico no sistema imunológico dos mamíferos [50]. Quando miR-138-5p foi desativado, observamos um aumento na edição de RNA em chr19: 10462087 em TYK2 (Fig. 6c). Nossos resultados sugerem que um sinal eQTL de TYK2 é gerado a partir da interação entre o edQTL em chr19: 10462087 e miR-138-5p. Este eQTL pode dar origem a vários traços GWAS relacionados ao sistema imunológico. Ambos os sinais eQTL e edQTL colocalizam com características GWAS para lúpus eritematoso sistêmico e porcentagem de neutrófilos em leucócitos (Fig. 6e). Deve-se notar que as alterações de edição de RNA detectadas por RNA-seq em resposta à perturbação de miRNA podem ser devido a efeitos diretos de miRNA na degradação de transcritos editados vs não editados, ou por meio de efeitos secundários que estão a jusante de outras vias regulatórias. Por exemplo, a regulação de miRNA de uma proteína de ligação de RNA pode, por sua vez, afetar a estabilidade do transcrito de uma maneira específica de edição.

Nós propomos um modelo no qual eventos de edição de RNA regulados por cis podem modular os níveis de transcrição de estado estacionário e características complexas (Fig. 8). Na presença de um miRNA que visa preferencialmente a versão editada ou não editada do transcrito, um sinal eQTL pode surgir de um sinal edQTL por meio da degradação da transcrição mediada por miRNA específico de edição. A variação nas características fenotípicas pode resultar da variação dos níveis de transcrição em estado estacionário. Isso é demonstrado no exemplo de DHFR em que miR-125a-3p liga o edQTL em chr5: 79923430 com o eQTL de DHFR reduzindo a estabilidade dos transcritos não editados. A alta expressão de DHFR no câncer de mama tem sido associada ao aumento da proliferação celular e resistência ao metotrexato, um agente quimioterápico [36]. Devemos notar que, embora o direcionamento diferencial do site DHFR não editado vs editado por miR-125a-3p fosse conhecido [36], nosso estudo relatou vários novos achados. Demonstramos que (1) o evento de edição de RNA em DHFR é geneticamente controlado, (2) o sinal edQTL colocaliza-se com o sinal eQTL de DHFR e (3) a colocalização edQTL: eQTL ocorre de maneira dependente da concentração de miRNA. Além disso, mostramos que esses ingredientes podem se reunir em um único gene para criar um eQTL.

Modelo esquemático que liga edQTLs a eQTLs e características complexas. Modelo esquemático do mecanismo regulatório no qual as interações entre a edição de RNA e a degradação do transcrito mediada por miRNA podem alterar os níveis de transcrição em estado estacionário, ligando, assim, variantes genômicas com características complexas

Para expandir o exemplo de DHFR, realizamos análises computacionais e experimentais para identificar eventos de co-localização edQTL: edQTL específicos de tecido adicionais mediados por interações diretas de edQTL-miRNA. Tirando vantagem do conjunto de dados edQTL abrangente de vários tecidos, fomos capazes de (1) identificar eventos de co-localização de edQTL: eQTL específicos de tecido, (2) atribuir alguns desses eventos de co-localização específicos de tecido a níveis de miRNA específicos de tecido, e (3) confirmar experimentalmente a regulação de miRNA-mRNA específica de edição usando ensaios repórter de luciferase 3'-UTR. Estes resultados demonstram que o exemplo de DHFR generaliza para outros genes e sites de edição de RNA.

Devemos observar que a lista de eventos edQTL que podem gerar eventos eQTL deve ser substancialmente maior do que os eventos candidatos identificados na Fig. 7. Em nossa análise, a fim de aprimorar os miRNAs potenciais computacionalmente, usamos critérios rigorosos para identificar o tecido -edQTL específico: colocalização eQTL e combinou esses sinais com miRNAs específicos de tecido identificados a partir dos dados GTEx. Esperamos que vários miRNAs também possam gerar eQTLs de edQTLs de uma maneira não específica para tecidos, embora esses candidatos sejam mais difíceis de identificar computacionalmente. Na verdade, o exemplo de DHFR não pôde ser identificado usando a estratégia computacional e os critérios rigorosos descritos na Fig. 7, porque todos os três tecidos com sinais significativos de edQTL tinham sinais eQTL de colocalização alta ou moderada.

Nosso estudo se concentrou em miRNAs como reguladores de ação trans que geram eQTLs de edQTLs. No entanto, esperamos que um cenário semelhante possa ocorrer com proteínas de ligação de RNA que regulam a estabilidade do RNA por meio de interações de proteína-RNA específicas de sequência. Na verdade, 14% dos locais edQTL (443 de 3117) têm pelo menos um tecido no qual o sinal edQTL se co-localiza com o sinal eQTL, sugerindo que um regulador de ação trans (miRNA ou proteína de ligação de RNA) pode alterar a estabilidade do RNA em um forma específica de edição. Em teoria, o controle de estabilidade de transcrição específico de edição por proteínas de ligação de RNA também poderia gerar um eQTL a partir de um edQTL existente. Foi demonstrado que ELAV1 / HuR estabiliza a versão editada das transcrições CTSS [51]. Se ELAV1 / HuR preferencialmente se liga e estabiliza a versão editada ou não editada de um site edQTL, um sinal eQTL deve surgir. Coletivamente, nosso estudo revela que a edição de RNA está subjacente a um mecanismo anteriormente não apreciado para gerar eQTLs em transcriptomas humanos, e fornecemos evidências computacionais e experimentais para o papel dos miRNAs na criação de eQTLs a partir de edQTLs.

Este trabalho expande o conhecimento prévio sobre eventos de edição de RNA geneticamente regulados de várias maneiras importantes. Estudos anteriores pesquisaram eventos de edição de RNA geneticamente regulados em um número limitado de tipos de células e tecidos. Em nosso trabalho anterior [27], usamos dados de RNA-seq de linhas de células linfoblastóides para encontrar associações entre variação genética e níveis de edição de RNA. Encontramos evidências para apoiar um modelo de que a variação genética cis modula os níveis de edição de RNA impactando a estrutura secundária do RNA. Além disso, descobrimos que alguns eventos de edição de RNA geneticamente regulados também estão associados a sinais GWAS, sugerindo possíveis consequências fenotípicas da variação de edição de RNA em características e doenças complexas. No entanto, no momento do estudo, não éramos capazes de fornecer pistas ou sugerir mecanismos moleculares concretos pelos quais eventos de edição de RNA geneticamente regulados afetam produtos e fenótipos de genes. Franzen e colegas usaram dados de RNA-seq do estudo Stockholm-Tartu Atherosclerosis Reverse Network Engineering Task (STARNET) para identificar eventos de edição de RNA geneticamente regulados em indivíduos com doença arterial coronariana em sete tecidos e duas linhas celulares [47]. Da mesma forma, o Consórcio CommonMind analisou dados de RNA-seq de indivíduos esquizofrênicos em duas regiões do cérebro para identificar eventos de edição de RNA geneticamente regulados que estão associados à esquizofrenia [48]. Neste trabalho, analisamos dados de seq de RNA em escala populacional de 7.989 amostras em 49 tecidos para expandir significativamente o catálogo de eventos de edição de RNA geneticamente regulados em transcriptomas humanos. Usando este conjunto de dados abrangente de 49 tecidos, fomos capazes de identificar edQTLs específicos de tecido e atribuir a especificidade de tecido observada aos níveis de expressão específicos de tecido de enzimas de edição de RNA (ADAR e ADARB1). Para investigar a interação entre a variação da edição de RNA e a variação da expressão gênica, realizamos uma análise de colocalização dos sinais edQTL e eQTL e encontramos evidências de que as variantes genéticas cis podem influenciar causalmente os níveis de edição de RNA e os níveis de expressão gênica simultaneamente. Por último, combinando análise computacional e validação experimental, encontramos evidências de que miRNAs podem gerar um sinal eQTL a partir de um locus edQTL, via degradação de transcrição mediada por miRNA de uma maneira específica de edição (Figs. 7 e 8). Tomados em conjunto, esses resultados avançam nossa compreensão conceitual das consequências funcionais da edição de RNA e sugerem que a variabilidade da edição de RNA pode influenciar características e doenças complexas, alterando a estabilidade e o nível de estado estacionário de moléculas de RNA críticas.


Resultados e discussão

À medida que a taxa de asma e obesidade comórbidas aumenta, é fundamental identificar os mecanismos pelos quais a obesidade afeta a asma. Nosso grupo relatou que os adipócitos viscerais obesos liberam exossomos contendo miRNAs que podem regular a expressão de genes de sinalização profibróticos no pulmão [24]. Um próximo passo importante em nossas análises foi definir o conjunto de respostas do mRNA do pulmão a esses exossomos derivados de adipócitos. Abordagens padrão anteriores teriam incluído a geração de uma lista de mRNAs alvo em potencial e a priorização deles para validação. miRTarVis nos apresentou uma nova oportunidade de definir objetivamente nosso conjunto de validação de mRNAs usando múltiplas análises in silico.


Por que os isomiR são importantes em amostras enriquecidas com EV?

Como o diâmetro dos EVs é normalmente inferior a 1 µm, sua carga máxima é mínima. Os exossomos, por exemplo, variam em

30-120 nm de diâmetro, então apenas algumas moléculas de microRNA poderiam ser montadas em uma partícula. Nesta visão, nem todos podem corresponder ao mesmo nome de microRNA, mas a maioria pode ser microRNA vazio. A média estimada do número de moléculas de microRNA por partícula de vesícula na faixa de tamanho dos exossomos é 1: 100 [[15]]. Com tal escassez, não é surpreendente que RT-qPCR seja a plataforma de validação preferida para a detecção de microRNAs transportados por EV - foi demonstrado que tão baixo quanto 10 moléculas por amostra podem ser detectadas usando esta plataforma [[68]]. Notavelmente, para experimentos de sRNA-seq, a quantidade de material inicial deve ser substancialmente maior (1-5 ng de pequenos RNAs enriquecidos). Quantidades menores podem ser usadas para a construção da biblioteca, mas os testes de qualidade e medições de concentração devem ser ignorados. Além disso, ciclos de amplificação de PCR mais elevados são necessários durante a construção da biblioteca, mas sabe-se que isso origina vieses de amplificação agudos [[5], [64], [69]].

Apesar da atual falta de nomenclatura que descreve completamente a natureza de cada classe de vesículas portadoras de microRNA [[6], [70]], as proporções de isomiRs detectadas em células parentais cultivadas são geralmente recapituladas em amostras enriquecidas com EV. Poucos estudos, no entanto, relataram que isomiRs específicos podem ser enriquecidos em EVs em comparação com as células parentais, sugerindo que a proporção EV / célula parental pode variar em certas circunstâncias. Koppers-Lalic et al. relataram que 3′-NTAs (isto é, isoformas 3′-uridiladas) estão super-representados no repertório de microRNAs de exossomos em comparação com suas células B parentais (que são bastante 3′-adeniladas) [[71]] o mesmo grupo posteriormente observaram isso em amostras de urina enriquecidas com EV de pacientes com câncer de próstata [[72]]. Li et al. relataram um enriquecimento em isoformas 3′-uridiladas para miR-214-3p em EVs de osteoclastos [[73]]. Considerando que tal NTA 3′-uridilação não foi observada em células hepáticas [[74]], outros estudos relataram diferenças em posições específicas de nucleotídeos dentro de microRNAs em amostras enriquecidas com EV [[75] - [78]], apoiando a noção de que uma sequência a heterogeneidade pode influenciar o empacotamento de microRNAs específicos em EVs, ou também promover sua retenção celular [[67]]. Mais pesquisas são necessárias para esclarecer as condições que podem promover associação isomérica específica com VEs.

Notamos que as alterações estequiométricas observadas para isomiRs específicos em amostras enriquecidas com EV mencionadas acima, onde discerníveis apenas após análises bioinformáticas de dados de sRNA-seq, como aqueles de Nejad et al. e Pillman et al. referido anteriormente. Uma vez que não está claro neste ponto o nível de sensibilidade em que microarrays ou sondas RT-qPCR discriminam entre isomiRs individuais, insights significativos podem ser inadvertidamente ignorados na literatura, uma situação que pode piorar para amostras com pequenas quantidades de pequenos RNAs.


Fundo

Algumas décadas atrás, as origens da descoberta de microRNA (miRNA) levaram a uma nova arena na biologia molecular. Em humanos, mais de 2.000 miRNAs foram descobertos e regulam mais de 25% dos genes. Muitas vezes está bem relacionado com várias doenças e, portanto, são úteis para o diagnóstico [1]. miRNAs, os RNAs não codificantes, são curtos, com quase vinte e dois nucleotídeos. É encontrado em eucariotos e eles fazem parte de todas as vias do nosso sistema biológico [2]. Controla os processos celulares como ciclo celular, inflamação, diferenciação celular e morte celular, por meio da inibição da estabilidade e tradução dos mRNAs. Assim, esses miRNAs são inevitáveis ​​em todos os processos biológicos e sinalização em uma célula. Sua desregulação costuma levar à gênese do câncer [3].

O primeiro miRNA foi descoberto no ano de 1993 e foi o resultado de dois estudos diferentes relatados Lin-4 como um pequeno RNA não codificador de Ceanorhabditis elegans gene heterocrônico lin-4 [4]. Naquela época, esse pequeno RNA não codificador era considerado uma ferramenta específica usada pelos vermes para gerenciar suas expressões gênicas heterocrônicas. Após 7 anos, Reinhart et al. [5] outros pequenos ncRNAs em C. elegância representado Let-7, o gene heterocrônico. Eles, juntamente com o RNA lin-4, estavam iniciando as cascatas de regulação de genes heterocrônicos via interação RNA-RNA na região 3 ′ não traduzida do gene alvo [5]. Isso levou a rastrear o outro pequeno ncRNA e desvendou a existência de ncRNAs em diferentes organismos nos quais atua como potencial controle regulatório e então denominado microRNAs [6,7,8]. Posteriormente foi identificado que todos são habitantes de plantas, animais e agora o banco de dados de miRNA revelou um total de 2.042 e 1.281 RNAs maduros em humanos e camundongos, respectivamente [9]. Em mamíferos, os genes de miRNAs têm parálogos, ou seja, diferentes isoformas, embora sejam bem conservados em animais. Havia 8 isoformas em 11 locos genômicos. Curiosamente, em C. elegans quase 55% dos miRNAs foram encontrados semelhantes aos humanos. A maioria do gene miRNA ocupa regiões distantes do gene anotado, muitas vezes devido a uma unidade de transcrição. Mais de 50% dos genes de miRNA são agrupados e normalmente transcritos como transcritos multcistrônicos de RNA. Em animais, constitui uma molécula reguladora de genes e tem impacto na expressão gênica e, portanto, no câncer exerce papel único no fenótipo da doença [3]. No câncer, miRNA desempenha um papel no início da doença, movimento da célula do local de origem, prognóstico da doença e resposta durante o tratamento [10].


Resultados

Validação do ensaio RISCtrap.

Inicialmente, geramos e testamos versões dominantes negativas de todos os três parálogos GW182 humanos - hTNRC6A 1-1213, hTNRC6B 1-1223 e hTNRC6C 1-1215 - e descobrimos que cada um agiu de maneira semelhante de maneira dependente da dose e dominante, sem efeitos aditivos . Em última análise, hTNRC6A 1-1213 (dnGW182) foi escolhido para uso subsequente. Sem seu domínio de silenciamento C-terminal, hTNRC6A 1-1213 foi presumido para atuar como um negativo dominante ao se ligar a Argonauta, mas não sendo capaz de recrutar os efetores necessários para o silenciamento e desestabilização do transcrito (11, 13, 15, 24, 27).

Para confirmar que dnGW182 devidamente incorporado em RISC, examinamos sua capacidade de se associar com as outras subunidades RISC, particularmente as proteínas Argonaute integrais. Flag – dnGW182 foi imunoprecipitado a partir de células HEK293T e as proteínas associadas foram analisadas por Western blot (Fig. 1UMA) Uma interação específica foi detectada com ambas as proteínas Argonaute endógenas 1 e 2 (Ago1 e Ago2, Fig. 1UMA), sugerindo que a abordagem RISCtrap pode capturar alvos dessas diferentes versões de RISC (41 ⇓ –43). Além disso, dnGW182 associado ao Ago2 com eficiências semelhantes na presença de diferentes microRNAs (Fig. 1B).

microRNA targets were stabilized by dnGW182, facilitating their enrichment by immunoprecipitation. (UMA e B) Flag–dnGW182 associated with endogenous Argonaute family members, and this association was similar with different microRNAs. Flag–PTBP2 is an unrelated control. (C, Superior) Schematic of the cassette encoding synthetic targets to monitor miR-132–RISC. (Diminuir) Relative abundance of transcripts in the presence of miR-132 and dnGW182, assessed by qPCR (2 -∆Ct , normalized to Gapdh). (D) Ratiometic analysis using flow cytometry revealed that dnGW182 stabilized GFP target transcripts and increased expression in individual cells. (E) Endogenous miR-124 targets (Plod3, Vamp3, and Ctdsp1) were specifically copurified with Flag–dnGW182 and miR-124. Similarly, the mRNA for GFP–132MRE was specifically enriched with Flag–dnGW182 in the miR-132 IP condition. In contrast, transcripts for negative control DsRed (Red) were not enriched. qPCR was used to analyze relative enrichment and abundance of transcripts in both IP and input samples, normalized to Gapdh.

We next tested the ability of dnGW182 to stabilize synthetic transcripts that represented ideal positive and negative control targets for miR-132. A stable HEK293T cell line was created that constitutively expressed two synthetic transcripts cotranscribed from a bidirectional promoter (Fig. 1C) As the positive control target for miR-132, one transcript encoded green fluorescent protein (GFP) with three reiterated bulged MREs in its 3′ untranslated region (3′UTR). The other transcript encoded DsRedExpress1 but lacked any MREs in its 3′UTR. Coexpression of these two transcripts allowed the use of quantitative measurements, such as flow cytometry analysis, to obtain ratiometric values in individual cells that reflected miR-132 activity (44). Expression of miR-132 decreased levels of the GFP transcript compared with a scrambled microRNA (miR-Scrm), without changing the abundance of the red transcript (Fig. 1C) Introduction of dnGW182 stabilized the GFP transcript in the presence of miR-132. We also observed an increase in basal GFP transcript levels upon addition of dnGW182, likely due to a block of endogenous miR-132 activity in these cells (Fig. S1). To confirm that the stabilized GFP transcript correlated with increased GFP expression in individual cells, we analyzed 10,000 cells from each condition with flow cytometry and plotted the cumulative frequency of the green/red ratio (Fig. 1D) Ectopic expression of miR-132 caused a leftward shift of the plot compared with miR-Scrm, representing a decrease of green fluorescence compared with red. Introduction of dnGW182 partially rescued the ratio to control levels. Together, the data demonstrated that dnGW182 could stabilize targeted transcripts.

To determine whether dnGW182 could facilitate the enrichment of targets, we expressed Flag–dnGW182 with either miR-132 or miR-124 in the cell line that constitutively expressed GFP–132MRE and red transcripts. Following a Flag immunoprecipitation (IP), co-enriched mRNAs were examined with qPCR. We observed a robust enrichment of GFP transcript specifically in the miR-132 IP sample and not in the miR-124 IP sample (Fig. 1E) Moreover, we saw a specific enrichment of previously reported endogenous miR-124 targets in the miR-124 IP sample. The red and Gapdh transcripts, neither of which were expected to be targets of either microRNA, were not enriched in either miR-132 or miR-124 IP conditions. Most notably, the fold enrichment we observed using RISCtrap was easily discernible over background by simply comparing the IP samples without having to normalize to input levels or identify canonical MREs.

Unbiased Screen for miR-124, miR-132, and miR-181 Targets.

To develop the RISCtrap assay into an unbiased screen for targets, we coupled it with deep sequencing (Fig. 2). The screen was performed as biological triplicates in HEK293T cells. We hypothesized that this cell line expressed many neuronal microRNA targets (45, 46). Illumina TruSeq libraries were prepared from enriched mRNAs and sequenced using a HiSeq v3 platform. We obtained ∼40–50 million reads per sample on average, 75% uniquely mapped to the RefSeq annotation and >90% of those to exonic regions (Fig. S2). Our RISCtrap datasets were composed of unique and variably sized datasets, so we developed a normalization strategy that would ensure retention of these distinct properties that likely reflected the specific targeting of each miRNA, while still allowing application of statistical methods for cross-comparison of current and future datasets (Figs. S3–S5 and Materiais e métodos SI) This would allow us to compare datasets from different experiments (i.e., replicates and different miRNAs) and even incorporate future RISCtrap datasets with previously obtained datasets. Significantly enriched transcripts for each microRNA were determined with pairwise comparisons among the triplicates using ANOVA (FDR < 0.15) and combined with an experimentally determined twofold enrichment cutoff. Our high confidence lists of targets for each miRNA (Dataset S1) were finalized by requiring more than one pairwise comparison indicating enrichment for the target (e.g., for miR-124: miR-124 vs. miR-181 and miR-124 vs. miR-132). Ultimately, some of the filtered candidates may be actual targets however, candidates that demonstrated enrichment in only a single pairwise comparison validated at ∼50%, which was not sufficiently rigorous for us to include in our high-confidence list but they are included in Dataset S2.

Use of RISCtrap as an unbiased screen for microRNA targets. This workflow depicts steps associated with the RISCtrap screen, including preparation of RISCtrap samples (Deixou) and our bioinformatic methodology to analyze differentially enriched targets (Direito).

Among our high-confidence miRNA targets, we found many published and also unknown hits (Fig. 3). Overall, we obtained 281 miR-124 targets, 262 miR-181 targets, and 94 miR-132 targets. Analysis of miR-124 targets revealed substantial overlap between our dataset and previously published miR-124 datasets, despite the assays being performed in different cell types using different strategies. Comparison with related Ago2-immunoprecipitation approaches (9, 10) revealed 86 and 99 overlapping targets, respectively, and comparison with high-throughput sequencing (HITS)-CLIP biological complexity (BC) 4 (8) revealed 53. The latter is particularly notable considering that the HITS-CLIP dataset was obtained from murine brain. Moreover, many targets also overlapped with microarray (6) and proteomic datasets (2) from HeLa cells (45 and 64 targets, respectively). This further supported the ability of RISCtrap to enrich targets that are actively down-regulated. Of particular interest was our miR-181 dataset in which we observed that almost half of the targets (125/262) were C2H2 class zinc-finger proteins. Moreover, 95 of these 125 targets shared the specific domain architecture of having an N-terminal KRAB domain followed by multiple tandem C2H2 motifs. Data from several recent papers using microarray and luciferase assays to study miR-181 similarly reported the regulation of this unusual cohort of targets (2, 38, 40).

RISCtrap screens in HEK293T cells for miR-124, mir-132, and miR-181 identified known and unique targets. All targets identified from the RISCtrap screens with miR-124, miR-132, and miR-181 are organized in a heatmap by biological replicates. (FDR < 0.15, fold enrichment ≥2.) Selected known miRNA targets are labeled and examples of previously unknown miR-132 targets are highlighted in yellow.

Examination of the target datasets revealed several interesting features (Fig. 3). First, grouping of targets by biological replicates produced an enrichment profile for each transcript that was extremely reproducible (Fig. S4) and the cohorts of candidate targets clearly segregated depending on the particular microRNA. Second, the number of targets for each microRNA depended on the identity of the microRNA, ranging from ∼100–300. Third, we found surprisingly minimal overlap among the target sets, suggesting that each miRNA may have its own characteristic set of targets (Fig. 3).

We selected candidate targets from the top, middle, and bottom of each microRNA target list, sorted by fold enrichment—representing highly, moderately, and modestly enriched candidates—for validation of binding using qPCR from an independent RISCtrap experiment (Fig. 4). Overall, we examined 149 targets and the validation rate was 96%, i.e., 143 targets ≥twofold enrichment. In particular, the observed fold enrichment of a target correlated with that detected by the RISCtrap screens (note different scales of the y axes). Analysis of RISCtrap miR-124 candidate targets with available microarray data from HeLa cells (6) suggested a trend where fold enrichment generally correlated with fold repression however, it was not statistically significant. Importantly, we additionally examined three transcripts that did not enrich in any of our RISCtrap screens to test as negative controls, Gapdh, Asp-His-His-Cys (DHHC)9, and DHHC17 none of these transcripts showed any enrichment in the miR-181, mir-124, or miR-132 RISCtrap screens (Fig. 4).

Validation of identified candidate targets confirmed microRNA-specific enrichment. Approximately 150 candidate targets from the three microRNA RISCtrap screens—representing candidates that were classified as highly enriched (UMA), moderately enriched (B), and modestly enriched (C)—were tested in an independent experiment for their copurification with RISCtrap using qPCR. Overall validation rate was 96%. Also included were three negative controls GAPDH, DHHC9, and DHHC17 (orange box). Y axes represent relative fold enrichment.

Characterization of MREs.

Using directed searches, we examined whether the target datasets obtained by RISCtrap contained expected microRNA binding motifs. Both canonical MREs and the recently described pivot or hinged MREs were examined (47). Approximately 90% of all targets contained an MRE corresponding to the targeting microRNA: 91.5% of miR-124 targets, 87.2% of miR-132 targets, and 92.4% miR-181 targets (Fig. 5UMA) The majority of targets contained at least an 8-mer, 7-mer-m8, or 7mer-a1 type motifs fewer had only a 6-mer or pivot MRE (7% miR-124, 20% miR-132, and 2% miR-181). Moreover, the frequency of 7mer-m8 motifs among nontargeted transcript pools was low, suggesting that the appropriate MRE motifs were specifically enriched among targeted transcripts. Appropriately, we also found that 82% of targets predicted to be coregulated by at least two miRNAs examined here contained MRE motifs for both microRNAs (Fig. S6UMA) We next examined the distribution of canonical 7mer-m8 sites among the miR-124 and miR-132 targets and discovered that the majority of MREs (60–80%) were located in the 3′UTR, with ∼20–30% in ORFs (Fig. 5B) In these cases, the relative position of MRE motifs along 3′UTRs appeared evenly dispersed (Fig. S6B) Conversely, the majority of miR-181 targets contained MREs in the ORFs and, in agreement with previously published reports, were specifically encoded within the C2H2 motif repeats (38, 40). Targets of miR-124 and miR-132 averaged ∼1 MRE per target in contrast, miR-181 targets averaged 5.5 MREs per target (Fig. 5C) Lastly, we performed de novo multiple expectation maximization for motif elicitation (MEME) analyses to identify overly represented sequences. This identified motifs that corresponded to canonical MREs for both miR-124 and miR-181 in the 3′UTRs of their respective targets, as well as many more in the ORFs of miR-181 targets (Fig. 5D) We did not identify the miR-132 motif with our de novo analysis, despite its high representation when performing a directed search. Most likely, this is due to a relatively higher reliance on 6-mer motifs compared with miR-124 and miR-181 (Fig. 5UMA) and this shorter motif is not easily distinguished by de novo analysis.

Identification of microRNA recognition element (MRE) motifs enriched among RISCtrap targets. (UMA) Percentages of transcripts in each dataset were classified by inclusion of at least 1 MRE motif and distribution of motif types. Each transcript is counted only once and classified according to inclusion of the following motifs in this order: 8-mer > 7mer-m8 > 7mer-a1 > 6-mer > pivot. (B) Distribution of candidate MREs is shown for each microRNA target dataset, based on its position in the target’s 5′UTR, ORF, or 3′UTR. (C) The mean number of 7mer-m8 MRE motifs per target is depicted for each microRNA dataset. (D) De novo MEME analysis using all targets from the miR-124 and miR-181 target datasets revealed canonical MRE motifs in the 3′UTR of miR-124 targets (296 motifs, P = 2.6 × 10 −108 ), in the 3′UTR of miR-181 targets (151 motifs, P = 1.3 × 10 −54 ), and in the ORF of miR-181 targets (1,000 motifs, P = 9.4 × 10 −1488 )

Identification of Previously Unrecognized miR-132 Targets, CRK and TJAP1.

RISCtrap identified many previously known targets. However, our datasets also identified previously unrecognized targets, many of which exhibited fold enrichments exceeding those of known targets. We selected two putative miR-132 targets, CRK and TJAP1, for further investigation. CRK is an adaptor protein for receptor tyrosine kinases and TJAP1 associates with tight junctions. Both candidates validated for specific enrichment in the miR-132 RISCtrap screen (Fig. 4) and available microarray data indicated that both were expressed at high levels in brain (48, 49). Moreover, each has a well-conserved MRE site in their 3′UTR (Fig. 6UMA) Incorporation of the 3′UTR sequence for either CRK or TJAP1 downstream of renilla luciferase in a dual luciferase assay conferred miR-132 regulation (WT) and mutation of the putative MRE (mut) caused it to be refractory to this regulation (Fig. 6UMA) We next asked whether these targets were stabilized in a miR-132 knockout mouse model. Examination of endogenous protein from whole cell lysates from the forebrain of litter-matched male siblings revealed an accumulation of CRK and TJAP1 in the miR-132 knockout animal (Fig. 6B) The abundance of negative controls DHHC9 (Fig. 4), α-tubulin, and Gapdh remained equivalent between wild-type and knockout samples. These data demonstrated that RISCtrap analysis of a nonneuronal cell type can identify previously unrecognized targets that are functionally regulated in the brain.

Two previously unknown miR-132 targets are regulated by miR-132 in mouse brain. (UMA) Conserved miR-132 MRE sequences were identified in the 3′UTR of both unique candidate targets CRK and TJAP1 (Principal) Luciferase assays in HEK293T cells demonstrated that each of their 3′UTR sequences conferred regulation by miR-132. Mutation of the predicted MRE (mutated sequences are bold and underlined) blocked miR-132 regulation. (B) Whole cell lysates from forebrains of litter-matched siblings of miR-132( +/+ ) and miR-132( −/− ) mice were probed for endogenous protein levels of previously unknown targets, CRK (isoforms I and II) and TJAP1, as well as known target Hb-EGF, and negative controls DHHC9, α-tubulin, and GAPDH.


Conception and design: I.J. Goossens-Beumer, C.J.H. van de Velde, P.J.K. Kuppen

Development of methodology: I.J. Goossens-Beumer, R.S. Derr, H.P.J. Buermans, P.J.K. Kuppen

Acquisition of data (provided animals, acquired and managed patients, provided facilities, etc.): I.J. Goossens-Beumer, R.S. Derr, H.P.J. Buermans, H. Morreau, U. Nitsche, K.-P. Janssen, C.J.H. van de Velde, P.J.K. Kuppen

Analysis and interpretation of data (e.g., statistical analysis, biostatistics, computational analysis): I.J. Goossens-Beumer, H.P.J. Buermans, J. Goeman, S. Böhringer, U. Nitsche

Writing, review, and/or revision of the manuscript: I.J. Goossens-Beumer, R.S. Derr, H.P.J. Buermans, S. Böhringer, H. Morreau, U. Nitsche, K.-P. Janssen, C.J.H. van de Velde, P.J.K. Kuppen

Administrative, technical, or material support (i.e., reporting or organizing data, constructing databases): I.J. Goossens-Beumer, H. Morreau, P.J.K. Kuppen

Study supervision: C.J.H. van de Velde, P.J.K. Kuppen


Assista o vídeo: What is microRNA miRNA? (Junho 2022).


Comentários:

  1. Babafemi

    Quero dizer, você não está certo.

  2. Kajigor

    Que frase ... super, uma ideia brilhante

  3. Dit

    Encontre errado?

  4. Osaze

    Agora vou ler mais ... puro =))))))

  5. Umar

    A mensagem está longe

  6. Thorp

    Por que não?



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