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Efeito dos valores 260/230 no PCR

Efeito dos valores 260/230 no PCR


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Até que ponto o valor 260/230 afeta a eficiência das reações de PCR? Os constituintes que levam a um valor baixo de 260/230 (EDTA, sais de guanidina e oligossacarídeos) inibem a PCR? Tenho obtido valores muito baixos de 260/230 (0,5-1,0) para DNA extraído usando o protocolo de troca de carga usando esferas magnéticas e o PCR tem falhado. Além disso, há algum motivo para eu estar obtendo valores baixos de 260/230 no método Charge Switch? (Eu estava obtendo bons valores usando o método de extração de fenol-clorofórmio)


Carboidratos EDTA, fenol, todos têm absorvância próxima a 230 nm. O reagente TRIzol é uma solução fenólica que absorve no UV tanto a 230 nm quanto a ~ 270 nm

Guanidina HCL usada para a maioria dos isolamentos de DNA irá absorver a ~ 230 nm também

Todas essas coisas irão inibir seriamente seu pcr (e diminuir sua proporção), especialmente os agentes desnaturantes como a guanadina.

Todos esses kits de DNA são spins diferentes de um processo bastante semelhante.

Se você tiver uma centrífuga estável, adira ao fenol e ao etanol. Certifique-se de secar bem o pellet, mas não seque demais. Vou ouvir meu pellet em 37 por 3-4 min para me livrar do etanol. Etanol não é bom em pcr. Se você odeia fazer precipitação de etanol (o que eu odeio) causa de pelotas invisíveis, adicione um pouco de glicogênio de alto teor à sua fase aquosa antes da precipitação. Isso tornará seu pellet visível e completamente inerte.

Se sua limpeza não for o problema, faça um recozimento e gradiente de Mg e aumente a quantidade de primer.

Pode querer dar-me mais informações, como a absorvância individual, as condições do pcr, o tamanho do modelo, etc.

Tradicionalmente, as purificações de esferas fornecem uma pureza realmente boa, razão pela qual eu as uso para microarranjos. Mas é caro e não é necessário para pcr.

O interruptor de carga está apenas mudando a carga do cordão, alterando o ph.


Causas comuns para taxas baixas de RNA A260 / 230 - (30 / jul / 2013)

Espero que alguém possa responder a algo que tem me confundido ultimamente.

Basicamente, colhi uma grande quantidade de RNA de células iMR90 e U2OS nos últimos dois ou três meses usando extração de Trizol, que depois limpo usando um mini kit Qiagen RNeasy. & # 160

Meu problema é que, para um experimento específico, todo o RNA que obtenho parece ter uma proporção baixa de A260 / 230 na nanogota, que ouvi dizer que é resultado de contaminação por fenol ou algum outro contaminante. O problema é que, quando eu limpo o RNA de vários experimentos juntos, é apenas esse único experimento que fornece taxas baixas de A260 / 230, portanto, provavelmente não é um problema causado durante a limpeza. & # 160

A única coisa que consigo pensar que é diferente é que essas amostras foram isoladas em Trizol e depois armazenadas a -80oC por mais algumas semanas do que o resto. & # 160

Isso causaria esse tipo de valor de absorbância? Não estou fazendo microarrays com o RNA e não pareço ter problemas em fazer cDNA para q-PCR, então é mais uma curiosidade do que um problema urgente que preciso resolver. Qualquer contribuição ou conselho seria definitivamente bem-vindo!

Agradecemos antecipadamente por sua ajuda / opiniões,

Com base em & # 160 minha experiência, por ter RNA mais claro, você deve limpar sua coluna mais uma vez pelo último buffer de kits.

Em RNeasy, você deve limpar a coluna duas vezes no final & # 160 pelo buffer RPE. Eu sugiro três vezes.

No Aurum & # 8482 Total RNA Mini Kit, você deve limpar a coluna uma vez por tampão de baixo teor de sal. Eu sugiro duas vezes.

memari em terça, 30 de julho 23:26:22 de 2013, disse:

Com base em & # 160 minha experiência, por ter RNA mais claro, você deve limpar sua coluna mais uma vez pelo último buffer de kits.

 

Em RNeasy, você deve limpar a coluna duas vezes no final & # 160 pelo buffer RPE. Eu sugiro três vezes.

 

No Aurum & # 8482 Total RNA Mini Kit, você deve limpar a coluna uma vez por tampão de baixo teor de sal. Eu sugiro duas vezes.

Vou tentar isso. Trabalhei com centenas de amostras de RNA ao longo dos anos e esta é a primeira vez que vejo isso acontecer, então com certeza tentarei adicionar uma terceira lavagem.

Uma extração apenas com clorofórmio após o trizol removerá grande parte do fenol.

Estou interessado em saber se você coloca todo o RNA isolado (após a extração do Trizol) no Qiagen RNeasy Mini, adicionando o tampão RLT e a etapa subsequente para a limpeza?

Eu havia extraído o RNA do Trizol, mas minha ração 260/230 está muito baixa e estou me perguntando o que devo fazer para melhorar a proporção?

wdyeo em Sun 4 de agosto 19:49:05 2013 disse:

Oi robradford,

 

Estou interessado em saber se você coloca todo o RNA isolado (após a extração do Trizol) no Qiagen RNeasy Mini, adicionando o tampão RLT e a etapa subsequente para a limpeza?

Eu havia extraído o RNA do Trizol, mas minha ração 260/230 está muito baixa e estou me perguntando o que devo fazer para melhorar a proporção?

Obrigado

para limpeza de RNA no protocolo Trizol, & # 160 lave mais de uma vez com etanol 75%:

1-Adicionar 50-100 ul de etanol 75% ao pellete de RNA e movê-lo para o novo frasco.

2-Adicione 1 ml de etanol 75% e vortex por 5-10s.

3 centrifugar 4000-7000 rcf (g) durante 1-3 min.

Para Trizol + Qiagen RNeasy Mini, existem duas maneiras:

1- Após adicionar Clorofórmio ao Trizol e centrifugar, passe a fase superior pelo Qiagen RNeasy Mini e siga em frente.

2- Faça Trizol compeletly e então adicione RLT buffer de RNeasy e vá em frente

Muito obrigado pela resposta

Tenha um bom dia & # 160

memari na terça-feira, 6 de agosto 03:09:41 de 2013 disse:

Para Trizol + Qiagen RNeasy Mini, existem duas maneiras:

 

1- Após adicionar Clorofórmio ao Trizol e centrifugar, passe a fase superior pelo Qiagen RNeasy Mini e siga em frente.

 

Depois de adicionar clorofórmio ao Trizol e centrifugar, algumas empresas sugerem adicionar um volume de etanol 70% ao sobrenadante e, em seguida, passá-lo pela coluna Qiagen RNeasy Mini e seguir em frente.


COVID-19: O que é o teste de anticorpos e como ele é diferente do PCR?

Tem sido afirmado em muitas reportagens que mesmo se o relatório for positivo para o teste RT-PCR, os pacientes que têm um valor de CT superior a 24 não espalharão a infecção.

Dr. Shahid Jameel falsifica tais afirmações. Ele diz que se alguém com valor de CT de 30 estiver em roaming sem máscara, é mais provável que espalhe o vírus do que uma pessoa infectada com valor de CT de 22 que permanece isolada. Em tal situação, fixar o corte em 24 pode enganar as pessoas.


O efeito dos métodos de extração de DNA em comunidades microbianas observadas de frações de rúmen fibroso e líquido de vacas leiteiras

Métodos baseados em DNA têm sido amplamente utilizados para estudar a complexidade da microbiota ruminal, e é bem conhecido que o método de extração de DNA é uma etapa crítica para permitir uma avaliação precisa dessa complexidade. As frações de fluido ruminal (RF) e de conteúdo fibroso (FC) diferem substancialmente em termos de sua natureza física e microrganismos associados. O objetivo deste estudo foi, portanto, avaliar o efeito de quatro métodos de extração de DNA (RBB, PBB, FDSS, PQIAmini) que diferem na lise celular e / ou métodos de recuperação de DNA sobre a diversidade microbiana observada em frações RF e FC usando amostras de quatro rúmen vacas leiteiras canuladas alimentadas com 100% de silagem de grama (GS100), 67% de GS e 33% de silagem de milho (GS67MS33), 33% de GS e 67% de MS (GS33MS67) ou 100% de MS (MS100). Um teste estatístico ANOVA foi aplicado nas medições de qualidade e rendimento de DNA, e verificou-se que o rendimento de DNA foi significativamente afetado pelo método de extração (p & lt 0,001) e fração (p & lt 0,001). A proporção 260/280 não foi afetada pela extração (p = 0,08), mas foi afetado pela fração (p = 0,03). Por outro lado, a razão 260/230 foi afetada pelo método de extração (p & lt 0,001), mas não afetado pela fração (p = 0,8). No entanto, todos os quatro procedimentos de extração produziram DNA adequado para análise posterior de comunidades de bactérias, archaeal e fungos anaeróbicos usando PCR quantitativo e pirosequenciamento de marcadores taxonômicos relevantes. A análise de redundância (RDA) dos dados da sequência do gene 16S rRNA bacteriano no nível da família mostrou que houve um efeito significativo da fração ruminal (p = 0,012), e esse PBB (p = 0,012) e FDSS (p = 0,024) também contribuiu significativamente para explicar a variação observada na composição da comunidade bacteriana. Embora o método de extração de DNA tenha afetado a composição aparente da comunidade bacteriana, nenhum método de extração pode ser considerado ineficaz. Nenhum efeito óbvio do método de extração de DNA nos fungos anaeróbios ou arquéias foi observado, embora os efeitos da fração fossem evidentes para ambos. Em resumo, a avaliação abrangente das comunidades observadas de bactérias, arquéias e fungos anaeróbios descritos aqui fornece uma visão sobre uma base racional para a seleção de uma metodologia ideal para obter uma imagem representativa da microbiota ruminal.

Palavras-chave: 454 pirosequenciamento métodos de extração de DNA archaea bactérias conteúdo fibroso fungos qPCR fluido ruminal.

Bonecos

Triplot de análise de redundância (RDA) mostrando ...

Triplot de análise de redundância (RDA) mostrando a relação entre os cinco principais níveis de família ...

Composição em nível de família bacteriana de ...

Composição em nível de família bacteriana de diferentes extratos de DNA obtidos do fluido ruminal (UMA)…

O efeito da extração de DNA ...

O efeito do método de extração de DNA (RBB, PDD, FDSS e PQIAmini) no ...

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Índice de riqueza Chao1 (UMA) e o índice de diversidade de Shannon (B) valores para todos os quatro ...

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Abundância relativa de táxons de archaea em nível de gênero dentro do fluido ruminal (UMA) e…


Reação em cadeia da polimerase

Nossos editores irão revisar o que você enviou e determinar se o artigo deve ser revisado.

Reação em cadeia da polimerase (PCR), uma técnica usada para fazer várias cópias de um segmento específico de DNA com rapidez e precisão. A reação em cadeia da polimerase permite que os investigadores obtenham grandes quantidades de DNA que são necessárias para vários experimentos e procedimentos em biologia molecular, análise forense, biologia evolutiva e diagnósticos médicos.

O PCR foi desenvolvido em 1983 por Kary B. Mullis, um bioquímico americano que ganhou o Prêmio Nobel de Química em 1993 por sua invenção. Antes do desenvolvimento da PCR, os métodos usados ​​para amplificar ou gerar cópias de fragmentos de DNA recombinante eram demorados e trabalhosos. Em contraste, uma máquina projetada para realizar reações de PCR pode completar muitas rodadas de replicação, produzindo bilhões de cópias de um fragmento de DNA, em apenas algumas horas.

A técnica de PCR é baseada nos processos naturais que uma célula usa para replicar uma nova fita de DNA. Apenas alguns ingredientes biológicos são necessários para a PCR. O componente integral é o DNA molde - ou seja, o DNA que contém a região a ser copiada, como um gene. Apenas uma molécula de DNA pode servir de modelo. A única informação necessária para que este fragmento seja replicado é a sequência de duas regiões curtas de nucleotídeos (as subunidades do DNA) em cada extremidade da região de interesse. Essas duas sequências modelo curtas devem ser conhecidas para que dois primers - pequenos trechos de nucleotídeos que correspondem às sequências modelo - possam ser sintetizados. Os primers se ligam, ou anelam, ao modelo em seus locais complementares e servem como ponto de partida para a cópia. A síntese de DNA em um primer é direcionada para o outro, resultando na replicação da sequência interveniente desejada. Também são necessários nucleotídeos livres usados ​​para construir as novas fitas de DNA e uma DNA polimerase, uma enzima que faz a construção adicionando sequencialmente nucleotídeos livres de acordo com as instruções do modelo.

A PCR é um processo de três etapas que é realizado em ciclos repetidos. A etapa inicial é a desnaturação, ou separação, das duas fitas da molécula de DNA. Isto é conseguido aquecendo o material de partida a temperaturas de cerca de 95 ° C (203 ° F). Cada fio é um modelo no qual um novo fio é construído. Na segunda etapa, a temperatura é reduzida para cerca de 55 ° C (131 ° F) para que os primers possam recozer com o molde. Na terceira etapa, a temperatura é elevada para cerca de 72 ° C (162 ° F), e a DNA polimerase começa a adicionar nucleotídeos nas extremidades dos primers recozidos. Ao final do ciclo, que dura cerca de cinco minutos, a temperatura sobe e o processo recomeça. O número de cópias dobra após cada ciclo. Normalmente, 25 a 30 ciclos produzem uma quantidade suficiente de DNA.

No procedimento de PCR original, um problema era que a DNA polimerase precisava ser reabastecida após cada ciclo porque não é estável nas altas temperaturas necessárias para a desnaturação. Este problema foi resolvido em 1987 com a descoberta de uma DNA polimerase estável ao calor chamada Taq, uma enzima isolada da bactéria termofílica Thermus aquaticus, que habita fontes termais. Taq a polimerase também levou à invenção da máquina de PCR.

Como o DNA de uma ampla variedade de fontes pode ser amplificado, a técnica foi aplicada a muitos campos. A PCR é usada para diagnosticar doenças genéticas e detectar baixos níveis de infecção viral. Na medicina legal, é usado para analisar vestígios minúsculos de sangue e outros tecidos, a fim de identificar o doador por sua “impressão digital” genética. A técnica também foi usada para amplificar fragmentos de DNA encontrados em tecidos preservados, como os de um mamute lanudo congelado de 40.000 anos ou de um humano de 7.500 anos encontrado em uma turfa.

Este artigo foi revisado e atualizado mais recentemente por Erik Gregersen, Editor Sênior.


Conteúdo

Edição de Desenvolvimento

Embora o conceito de marcadores de peso molecular tenha sido mantido, as técnicas de desenvolvimento variaram ao longo dos anos. Novas invenções de marcadores de peso molecular são distribuídas em kits específicos para o tipo de marcador.

Um problema inicial no desenvolvimento de marcadores foi alcançar alta resolução em todo o comprimento do marcador. [1] Dependendo das condições de execução da eletroforese em gel, os fragmentos podem ter sido comprimidos, prejudicando a clareza. Para resolver esse problema, um kit para análise de Southern Blot foi desenvolvido em 1990, fornecendo o primeiro marcador para combinar DNA alvo e DNA de sonda. Esta técnica aproveitou o espaçamento logarítmico e pode ser usada para identificar bandas alvo variando ao longo de um comprimento de 20.000 nucleotídeos. [2]

Edição de Design

Existem dois métodos comuns para construir um marcador de tamanho de peso molecular de DNA. [3] Um desses métodos emprega a técnica de ligadura parcial. [3] A ligação do DNA é o processo pelo qual pedaços lineares de DNA são conectados uns aos outros por meio de ligações covalentes. Mais especificamente, essas ligações são ligações fosfodiéster. [4] Aqui, um pedaço de DNA duplex de 100 pb é parcialmente ligado. A consequência disso é que se formarão dímeros de 200pb, trímeros de 300pb, tetrâmeros de 400pb, pentâmeros de 500pb, etc. Além disso, uma parte do dsDNA de 100 pb permanecerá. Como resultado, uma "escada" de DNA composta de pedaços de DNA de massa molecular conhecida é criada no gel. [3]

O segundo método emprega o uso de enzimas de restrição e uma sequência de DNA reconhecida. [3] O DNA é digerido por uma enzima de restrição específica, resultando em pedaços de DNA de massas moleculares variáveis. Uma das vantagens deste método é que mais marcadores podem ser facilmente criados simplesmente digerindo mais do DNA conhecido. [3] Por outro lado, o tamanho dos pedaços de DNA são baseados nos locais onde a enzima de restrição corta. Isso torna mais difícil controlar o tamanho dos fragmentos no marcador. [5]

Mais recentemente, outro método para construir marcadores de tamanho de peso molecular de DNA está sendo empregado por laboratórios. Essa estratégia envolve o uso da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR). [5] Isso é conseguido de uma ou duas maneiras: 1) um alvo de DNA é amplificado ao mesmo tempo por meio de conjuntos de primers ou 2) alvos de DNA diferentes são amplificados independentemente por meio de primers específicos. [5]

Efeitos das condições do gel Editar

Tal como acontece com as amostras experimentais, as condições do gel podem afetar o marcador de tamanho de peso molecular que corre ao lado deles. Fatores como tampão, carga / voltagem e concentração de gel podem afetar a mobilidade e / ou a aparência de seu marcador / escada / padrão. Esses elementos devem ser levados em consideração ao selecionar um marcador e ao analisar os resultados finais em um gel.

Edição de Desenvolvimento

Anteriormente, os marcadores de proteína foram desenvolvidos usando uma variedade de proteínas inteiras. O desenvolvimento de um kit incluindo um marcador de tamanho de peso molecular baseado em fragmentos de proteínas teve início em 1993. Esse marcador de proteína, composto por 49 sequências de aminoácidos diferentes, incluía proteínas de múltiplos domínios, e permitia a análise de proteínas clivadas em diferentes sítios. [9]

As melhorias técnicas atuais em marcadores de proteína envolvem o uso de autodesenvolvimento. O primeiro marcador de proteína de peso regular auto-desenvolvido foi inventado em 2012. [10]

Edição de Design

Semelhante aos marcadores de DNA, esses marcadores são tipicamente compostos de proteínas purificadas cujas massas moleculares já são conhecidas. [3] A lista abaixo descreve algumas das proteínas, bem como a massa molecular, que são comumente usadas na construção de um marcador de proteína.

Escolhendo o marcador de proteína correto Editar

Os marcadores de tamanho de peso molecular podem ser divididos em duas categorias: marcadores de peso molecular vs. marcadores de escada molecular. [14] Os marcadores são manchados ou não e, dependendo da circunstância, um pode ser mais apropriado do que outro. Os marcadores de tamanho de peso molecular também podem ser alterados bioquimicamente. [15] A conjugação com biotina é a mais comum. Os marcadores de tamanho de peso molecular são mais comumente usados ​​em eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida e Western blotting. Com todos os diferentes tipos e usos de marcadores de tamanho de peso molecular, é importante escolher o padrão de proteína apropriado. Além do uso mais comum, como forma de calcular o peso molecular das amostras, outros usos incluem permitir evidências visuais de migração de proteínas e eficiência de transferência e, às vezes, até mesmo para controle positivo. [16]

Um marcador de peso molecular é um tipo de padrão de proteína. Eles podem ser pré-corados ou não antes do carregamento, dependendo do tipo de experimento, um pode ser mais vantajoso. Em ambos os casos, eles são normalmente executados na pista externa de um gel, enquanto a amostra é carregada nas pistas do meio. [14] Os marcadores moleculares são diferentes das escadas de proteínas porque são compostos de uma mistura de proteínas nativas cujas especificações são bem categorizadas, mas não correspondem a números inteiros. [14] Geralmente são muito mais baratos, mas a análise permite apenas um valor aproximado das proteínas separadas por eletroforese. [14] Uma escada de proteína é outro tipo de padrão de proteína. Quase sempre estão manchados. [14] Escadas de proteína diferem de marcadores moleculares por serem compostas de uma mistura de proteínas altamente purificadas cujas especificações são conhecidas e correspondem a números inteiros. [14] Geralmente, escadas de proteínas são compostas por 10-12 proteínas. [14] No final do experimento, após ocorrer a migração de tamanho, uma única banda representará o tamanho de cada proteína contida na escada. [17] Os marcadores são espaçados uniformemente e a análise de tamanho usando esses marcadores permite um valor preciso da proteína de interesse. Em alguns casos, como um método de confirmação molecular, os marcadores de MW são executados com escadas de proteína para verificação. [14] Os marcadores de proteína podem vir sem coloração ou pré-corados, mas ambos têm seus benefícios e desvantagens. [18] A visualização simples da separação e transferência de proteínas é possível através do uso de marcadores pré-corados. [18] Eles são comumente usados ​​em eletroforese em gel de SDS-poliacrilamida e Western blotting. Em SDS-PAGE, permite o monitoramento da migração de proteínas, pois as bandas de proteínas se separam e podem ser vistas durante uma corrida eletroforética. Em western blots, os padrões de proteína corados permitem a transferência de proteína de visualização para a membrana. [17] No entanto, as determinações de tamanho não são tão precisas com esses marcadores (consulte a seção Marcador Recombinante e Natural para obter mais explicações). [18] Embora os marcadores não corados permitam determinações de tamanho mais exatas, eles não podem ser visualizados enquanto o gel está em execução. Assim, o gel deve ser corado para a visualização das bandas. [19] Além dos marcadores corados e não corados, os marcadores de proteínas podem ser considerados recombinantes e naturais. [18] Os marcadores recombinantes consistem em proteínas recombinantes que foram amplamente purificadas. Esses marcadores são projetados de forma a destacar características particulares. [18] Exemplos dessas características incluem etiquetas de afinidade e pesos moleculares que são posicionados uniformemente em relação uns aos outros. [18] Os marcadores naturais, como o nome indica, são uma mistura de proteínas que ocorrem naturalmente. [18] Marcadores naturais pré-corados funcionam bem para a visualização da separação do gel. No entanto, esses marcadores tendem a se ligar à mancha de forma covalente em quantidades variáveis ​​e em várias posições. [18] Consequentemente, as bandas resultantes podem ser mais largas. Isso é especialmente verdadeiro ao fazer comparações com marcadores recombinantes pré-corados. Devido a este efeito, as determinações do peso molecular são provavelmente menos precisas com os marcadores naturais pré-corados. [18] Os padrões de proteína também podem ser alterados quimicamente. Uma alteração comum é pelo uso de biotina. A biotina tem uma afinidade muito alta para a estreptavidina e, portanto, a ligação forma um complexo muito forte. Para visualização, uma etiqueta colorida é anexada à estreptavidina. [15]

Efeitos das condições do gel Editar

Tal como acontece com a eletroforese de DNA, condições como tampões, carga / voltagem e concentração devem ser levadas em consideração ao selecionar um marcador de proteína.

Os buffers podem afetar a mobilidade do marcador e das amostras. O pH do tampão varia com o sistema utilizado e, conseqüentemente, cada sistema tampão terá um efeito diferente na carga de uma proteína ou proteínas. [20] Além disso, no caso de SDS-PAGE, a afinidade de ligação para SDS pode ser afetada pelo sistema de tamponamento. [20] Mesmo quando usando a mesma porcentagem e tipo de gel, as mesmas proteínas irão migrar em taxas diferentes dependendo do tampão usado. [20] A voltagem desempenha um papel na mobilidade das proteínas em um gel. As proteínas migrarão mais rápido em tensões mais altas. Consequentemente, o tempo de execução do gel será mais curto. Por outro lado, tensões mais altas podem resultar em maior difusão de banda. [20] Além disso, se a voltagem for muito alta, a temperatura na câmara de eletroforese pode tornar-se tal que o gel começa a derreter. [20] A voltagem na qual um gel deve ser executado depende do tipo de gel. Para alguns géis, a voltagem permanece constante durante toda a execução, enquanto, com outros géis, a voltagem inicial pode permanecer constante por um tempo especificado antes de ser aumentada. [20] Essa segunda tensão é então usada por um período de tempo específico, após o qual também pode ser aumentada. [20] Em termos de porcentagem, os géis usados ​​para eletroforese de proteínas podem ser divididos em géis de porcentagem única e géis de gradiente. [18] Os géis de porcentagem única também são chamados de géis lineares. [20] Para géis lineares, a porcentagem selecionada geralmente fica entre 7,5% e 20%. [18] Faixas de porcentagem comuns para géis de gradiente são 4-15% e 10-20%. Cada tipo de gel tem suas próprias vantagens. [18] Por exemplo, géis lineares são preferidos quando várias proteínas têm pesos moleculares semelhantes, uma melhor separação entre essas proteínas será exibida por um gel linear. [18] Por outro lado, géis de gradiente são uma escolha melhor quando as amostras de interesse contêm proteínas de pesos moleculares muito diferentes ou que cobrem uma grande variedade de pesos moleculares. [18] [20]

Edição de Desenvolvimento

Escadas de RNA compostas por marcadores de tamanho de peso molecular de RNA foram inicialmente desenvolvidas usando o método de círculo sintético [21] para produzir marcadores de tamanhos diferentes. Esta técnica foi aprimorada pelo inventor Eric T. Kool para usar vetores circulares de DNA como um método para a produção de marcadores de tamanho de peso molecular de RNA. Conhecido como método de círculo rolante, as melhorias dessa técnica decorrem de sua eficiência na síntese de oligonucleotídeos de RNA. A partir do molde circular de DNA, o RNA de fita simples variando em comprimento de 4-1500 bp pode ser produzido sem a necessidade de iniciadores e reciclando trifosfato de nucleotídeo. O DNA também pode ser sintetizado a partir do molde circular, aumentando a versatilidade dessa técnica. Em comparação com a transcrição do escoamento, o método do círculo sintético produz oligonucleotídeos de RNA sem o escoamento. Em comparação com a PCR, o método do círculo sintético produz oligonucleotídeos de RNA sem a necessidade de polimerase nem de um termociclador. Este método também é econômico em sua capacidade de sintetizar grandes quantidades de produto com uma taxa de erro menor do que os sintetizadores de máquina. [21]

Edição de Design

Os marcadores de RNA consistem em transcritos de RNA de vários comprimentos incrementais. Por exemplo, o marcador Lonza 0,5-9 kbp [22] tem bandas marcando pares de 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, 5, 6 e 9 quilobases. Os marcadores são dissolvidos em um tampão de armazenamento, como o EDTA, e podem ter uma vida útil de até 2 anos quando armazenados a -80 ° C. Para usar o marcador, como para a análise de Northern blot, ele é primeiro descongelado e, em seguida, corado para que seja detectável em uma eletroforese em gel. Um dos corantes mais comuns usados ​​para marcadores é o brometo de etídio.

O intervalo de um determinado marcador se refere à variedade de bandas que ele pode mapear. Uma faixa "alta" se refere a fragmentos relativamente grandes (medidos em kb), enquanto uma faixa "baixa" se refere a marcadores que distinguem entre fragmentos pequenos (medidos em bp). Alguns marcadores podem até ser descritos como "alcance ultrabaixo", [16] mas ainda mais preciso é o marcador microRNA. Um marcador de microRNA pode ser usado para medir fragmentos de RNA dentro de uma dúzia de nucleotídeos, como o marcador de microRNA de 17-25 nt. [23]

Use Editar

Com pesos moleculares equivalentes, o RNA migrará mais rápido do que o DNA. No entanto, tanto o RNA quanto o DNA têm uma inclinação linear negativa entre a distância de migração e o peso molecular logarítmico. [24] Ou seja, amostras de menor peso são capazes de migrar por uma distância maior. Essa relação deve ser levada em consideração ao escolher marcadores de RNA ou DNA como padrão.

Ao executar marcadores de RNA e amostras de RNA em um gel, é importante evitar a contaminação por nuclease, pois o RNA é muito sensível à degradação da ribonuclease (RNase) por meio da catálise. [25] [26] Assim, todos os materiais a serem utilizados no procedimento devem ser levados em consideração. Qualquer vidraria que entre em contato com o RNA deve ser pré-tratada com dietilpirocarbonato (DEPC) e os materiais plásticos devem ser descartáveis. [25]

Um dos usos mais comuns para marcadores de tamanho de peso molecular é na eletroforese em gel. O objetivo da eletroforese em gel é separar proteínas por propriedades físicas ou químicas, que incluem carga, tamanho molecular e pH. & Lt Ao separar com base no tamanho, o método ideal é SDS-PAGE ou eletroforese em gel de poliacrilamida e marcadores de tamanho de peso molecular são os padrões apropriados a serem usados.

Os géis podem variar em tamanho. O número de amostras a serem testadas determinará o tamanho de gel apropriado. Todos os géis são divididos em linhas paralelas ao gel. Cada pista conterá uma amostra específica. Normalmente, os padrões de tamanho de peso molecular são colocados em uma faixa externa. Se um gel tem um número particularmente alto de pistas, então várias escadas podem ser colocadas através do gel para maior clareza.

Proteínas e padrões são pipetados no gel em pistas apropriadas. O dodecilsulfato de sódio (SDS) interage com as proteínas, desnaturando-as e dando-lhes uma carga negativa. Uma vez que todas as proteínas têm a mesma relação carga-massa, a mobilidade da proteína através do gel será baseada apenas no peso molecular. Assim que o campo elétrico for ligado, a migração da proteína será iniciada. Após a conclusão, um mecanismo de detecção, como western blotting, pode ser usado, o que revelará a presença de bandas. Cada banda representa uma proteína específica. A distância da viagem é baseada unicamente no peso molecular, portanto, o peso molecular de cada proteína pode ser determinado comparando a distância de uma proteína desconhecida com o padrão de peso molecular conhecido. [27]

Existem muitos tipos de marcadores de tamanho de peso molecular e cada um possui características únicas, o que leva ao seu envolvimento em várias técnicas biológicas. A seleção de um marcador de tamanho de peso molecular depende do tipo de marcador (DNA, RNA ou proteína) e da faixa de comprimento que ele oferece (por exemplo, 1kb). Antes de selecionar um marcador de tamanho de peso molecular, é importante se familiarizar com essas características e propriedades. Em um caso particular, um tipo pode ser mais apropriado do que outro. Embora os marcadores específicos possam variar entre os protocolos de uma dada técnica, esta seção descreverá os marcadores gerais e suas funções.

Allozymes Edit

O primeiro tipo de marcador molecular desenvolvido e executado em eletroforese em gel foram as alozimas. Esses marcadores são usados ​​para a detecção da variação da proteína. A palavra "alozima" (também conhecida como "aloenzima") vem de "variantes alélicas de enzimas". [28] Quando executado em um gel, as proteínas são separadas por tamanho e carga. Embora as alozimas possam parecer desatualizadas quando comparadas aos outros marcadores disponíveis, ainda hoje são utilizadas, principalmente pelo baixo custo. Uma grande desvantagem é que, como há apenas uma quantidade limitada disponível, a especificidade é um problema. [28]

Marcadores baseados em DNA (anos 1960) Editar

Embora as alozimas possam detectar variações no DNA, é por um método indireto e não muito preciso. Marcadores baseados em DNA foram desenvolvidos na década de 1960. [28] Esses marcadores são muito mais eficazes na distinção entre variantes de DNA. Hoje, esses são os marcadores mais usados. Os marcadores baseados em DNA trabalham examinando os nucleotídeos, que podem servir a uma variedade de funções, como detectar diferenças nos nucleotídeos ou mesmo quantificar o número de mutações. [28]

O polimorfismo do comprimento do fragmento de restrição é uma técnica usada para detectar variações no DNA homólogo. [29] Endonucleases de restrição específicas são usadas para digerir DNA. O marcador molecular RFLP é específico para um único fragmento. Junto com os marcadores RFLP aléicos, um marcador de tamanho de peso molecular, neste caso um marcador de DNA, [30] também é incluído em um gel de agarose com eletorforos. O marcador de DNA permite estimar o tamanho dos fragmentos de restrição. Semelhante ao RFLP, esta técnica também usa endonucleases de restrição para digerir o DNA genômico. Minissatélites são sequências curtas de repetições em tandem, aproximadamente 10-60 pares de bases. Minissatélites podem ser usados ​​na pegada de DNA e como reguladores do controle de genes. [28]

Marcadores baseados em PCR (década de 1980) Editar

O sucesso dos marcadores baseados em DNA levou ao desenvolvimento da PCR. PCR (reação em cadeia da polimerase) é uma técnica de amplificação de DNA que pode ser aplicada a vários tipos de fragmentos. Antes desse desenvolvimento, para amplificar o DNA, ele precisava ser clonado ou isolado. Pouco depois da descoberta do PCR, surgiu a ideia de usar marcadores baseados em PCR para eletroforese em gel. Esses tipos de marcadores são baseados em primers de PCR e são categorizados como polimorfismo de sequência de DNA. [28]

Edição de polimorfismo de sequência de DNA

Embora tecnicamente falando, o polimorfismo da sequência de DNA tenha ocorrido desde o uso do RFLP na década de 1960, a análise mudou significativamente ao longo dos anos. O polimorfismo da sequência de DNA usa técnicas mais antigas, como RFLP, mas em uma escala maior. O sequenciamento é muito mais rápido e eficiente. A análise é automatizada, pois utiliza uma técnica conhecida como sequenciamento shotgun. Este método de alto rendimento é comumente usado em genética populacional. [28]

SNPs (single nucleotide polymorphism), are used to detect variations in single nucleotides. The technique is very similar to that of RFLP. SNPs are used frequently for population genetic studies. [35] After amplification through PCR, these small fragments can be visualized using gel electrophoresis, and again DNA markers play a role in determining fragment length.

Polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis Edit

Carbohydrate markers are employed in a technique known as polysaccharide analysis by carbohydrate gel electrophoresis (PACE), which is a measurable separation technique. [36] It allows for the analysis of enzyme hydrolysis products. [36] It has been used in applications such as characterizing enzymes involved in hemicellulose degradation, determining the structure of hemicellulose polysaccharides, and analysis of enzymatic cleavage of cellulose products. [36]

PACE depends on derivitization, which is the conversion of a chemical compound into a derivative. [36] [37] Here monosaccharides, oligosaccharides, and polysaccharides are the compounds of interest. They are labeled at their reducing ends with a fluorescent label (i.e. a fluorophore). [36] This derivitization with a fluorophore permits both separation on a gel under the desired circumstances and fluorescence imaging of the gel. In this case, a polyacrylamide gel is used. [36]

As with DNA, RNA, and protein electrophoresis, markers are run alongside the samples of interest in carbohydrate gel electrophoresis. [36] The markers consist of oligosaccharides of known molecular weight. Like the samples of interest, the marker is also derivitized with a fluorophore (usually with 8-aminonaphthalene-1,3,6-trisulfonic acid (ANTS) or 2-aminoacridone). [36]


Conclusão

The ultra low error rate of Q5 is extremely beneficial for many applications. However, the low number of identified errors makes absolute error rate quantitation difficult for this enzyme, even with extensive experimentation and analysis. From blue/white screening, we have observed that Q5 is approximately 200X more faithful at replicating DNA than Taq, but results from Sanger sequencing hint that this value may actually be an underestimate.

Because the values generated from blue/white methods vary significantly between individual replicates and rely on a series of calculated extrapolations, we have chosen to conservatively represent the fidelity of Q5 High-Fidelity DNA Polymerase as >100X Taq, and Phusion HighFidelity DNA Polymerase as >50X Taq. With ever-decreasing costs and extremely large datasets, next generation sequencing techniques may soon be able to provide direct, cost effective methods for more accurately quantitating error rates for an ultra high-fidelity polymerase like Q5.

Translating blue/white error rates into practical use, this data suggests that after using 25 PCR cycles to amplify a 400 bp fragment with Taq, several isolates should be screened since about half of the clones are predicted to have an error. For larger fragments of

1000 bp, each clone amplified with Taq is likely to have an undesired mutation while the ultra low error rates of Q5 High-Fidelity DNA Polymerase predict that 199/200 clones amplified with this new enzyme will be correct.


CRP and Apoptosis

There has been little research conducted into the effect of CRP on the proliferation process. However, there is evidence that CRP has a major role in the apoptosis process. Devaraj et al. (81) showed that CRP stimulates the production of pro-apoptotic cytokines and inflammatory mediators através da the activation of Fc-γ receptors. The pro-apoptotic cytokines and inflammatory mediators induced by CRP include interleukin-1β (IL-1β), tumor necrosis factor-α (TNFα), and reactive oxygen species (82, 83).

C-reactive protein induces the upregulation of p53 in monocytes and affects cell cycle kinetics of monocytes through CD32 (FcγRII), inducing apoptosis by G2/M arrest in the cell cycle (84). CD32 receptors have been shown to trigger apoptotic signals and are expressed in a subset of monocytes that polarize to pro-inflammatory macrophages, suggesting that CRP may dampen macrophage-driven pro-inflammatory responses by inducing apoptosis (85).

C-reactive protein is elevated in cardiovascular disorders and is a mediator of atherosclerosis. CRP localizes directly in the atherosclerotic plaques where it induces the expression of genes that are directly involved in the adhesion of monocytes and the recruitment of intracellular molecules such as E-selectin and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1). CRP has also been shown to play a role in mediating low-density lipoprotein uptake in macrophages and activating the complement system, which is implicated in atherogenesis (86). Apoptosis occurs in atherosclerotic plaques and the number of apoptotic cells increase as lesions become more advanced. As cells become apoptotic, they start to cause plaque disruption, leading to the expression of growth arrest- and DNA damage-inducible gene 153 (GADD153). GADD153 upregulation has been shown to induce G1 arrest or apoptosis in some cancer cell lines (87). Blaschke et al. (88) found that CRP can induce the apoptosis of human coronary vascular smooth muscle cells through a caspase-mediated mechanism, especially through increased caspase-3 activity. CRP was co-localized to the GADD153 gene product in atherosclerotic lesions suggesting that CRP is triggering the caspase cascade and apoptosis by inducing the expression of the GADD153 gene.

There is little research on how the two isoforms of CRP interact with the apoptosis process. It is suggested that CRP can exert anti-apoptotic activity but only when the cyclic pentameric structure is lost. This would suggest that the apoptotic activity of CRP is induced through the native isoform. Native CRP (nCRP) can bind to low-affinity IgG FcγRIIa (CD32) and IgG FcγRI (CD64), leading to depressed functional activities, degranulation, and the generation of superoxide by inducible respiratory burst. On the other hand, mCRP binds to low-affinity IgG FcγRIIIb (CD16) that can delay apoptosis by triggering the cell survival pathway in neutrophils, even at low concentrations (89).

The nCRP isoform has the ability to opsonize apoptotic cells and induce the phagocytosis of damaged cells. Removal of nCRP-bound apoptotic monocytes and macrophages may be através da FcγR-mediated phagocytosis (84). CRP binds to apoptotic cells, inhibits the assembly of terminal complement components, and promotes the opsonization of apoptotic cells (89, 90).


Predicting the function of islets after transplantation

Ratio of unmethylated to methylated insulin DNA

This ratio is a marker of beta-cell death and new-onset T1D. 35,49 Unmethylated and methylated insulin DNA are detectable in patient serum using droplet digital PCR within 2 h of cell injury or death and after transplant. 3,49 Unmethylated and methylated DNA are differentiated by bisulfite treatment of circulatory DNA. 49 About 50% of patients have high methylated and unmethylated insulin DNA 90 days posttransplant, which is associated with a higher hyperglycemia risk ( Fig. 3 ). 49,50 It was later recognized that unmethylated DNA is specific to beta-cell death, while methylated DNA can arise from any non-beta islet cell or exocrine tissue. 49 Further study is necessary to determine the impact of isolation, instant blood-mediated inflammatory reaction, and cotransplanted acinar tissue on the expression of unmethylated and methylated insulin DNA. This ratio does not currently predict the insulin secretory potential of beta cells after revascularization. This biomarker is also limited by a short half-life. 49

Fig. 3 . Islet nucleic acids are potential biomarkers due to a significant change in expression after the stress of transplantation. Depletion of circular RNAs circHIPK3 and ciRS-7/CDR1 results in impaired beta cell function. High levels of methylated insulin DNA in alpha cells and unmethylated insulin DNA in beta cells is associated with a higher hyperglycemia risk. miRNA-375 and miRNA-200c anticipate graft function in TPIAT. Βlinc2 and βlinc3 lncRNAs contribute to beta-cell dysfunction after transplant.


Assista o vídeo: PCR quantitativa qPCR (Junho 2022).


Comentários:

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