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12.1: Micróbios e as ferramentas da Engenharia Genética - Biologia

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objetivos de aprendizado

  • Identificar ferramentas de genética molecular que são derivadas de microorganismos
  • Descreva os métodos usados ​​para criar moléculas de DNA recombinante
  • Descrever métodos usados ​​para introduzir DNA em células procarióticas
  • Liste os tipos de bibliotecas genômicas e descreva seus usos
  • Descreva os métodos usados ​​para introduzir DNA em células eucarióticas

Nota parte 1

Kayla, uma engenheira elétrica de 24 anos e entusiasta da corrida, acabou de se mudar do Arizona para New Hampshire para aceitar um novo emprego. Nos fins de semana de folga, ela adora explorar seu novo ambiente, fazendo longas corridas nas florestas de pinheiros. Em julho, ela passou uma semana caminhando pelas montanhas. No início de agosto, Kayla desenvolveu febre baixa, dor de cabeça e dores musculares leves, e ela se sentiu um pouco cansada. Sem pensar muito nisso, ela tomou um pouco de ibuprofeno para combater seus sintomas e prometeu descansar mais.

Exercício ( PageIndex {1} )

Que tipos de condições médicas podem ser responsáveis ​​pelos sintomas de Kayla?

A ciência de usar sistemas vivos para beneficiar a humanidade é chamada de biotecnologia. Tecnicamente falando, a domesticação de plantas e animais por meio de práticas agrícolas e de criação é um tipo de biotecnologia. No entanto, em um sentido contemporâneo, associamos a biotecnologia com a alteração direta da genética de um organismo para alcançar características desejáveis ​​por meio do processo de engenharia genética. A engenharia genética envolve o uso de tecnologia de DNA recombinante, o processo pelo qual uma sequência de DNA é manipulada em vitro, criando assim molécula de DNA recombinantesque possuem novas combinações de material genético. O DNA recombinante é então introduzido em um organismo hospedeiro. Se o DNA introduzido vier de uma espécie diferente, o organismo hospedeiro agora é considerado transgênico.

Um exemplo de microorganismo transgênico é a cepa bacteriana que produz insulina humana (Figura ( PageIndex {1} )). O gene da insulina de humanos foi inserido em um plasmídeo. Este plasmídeo de DNA recombinante foi então inserido em bactérias. Como resultado, esses micróbios transgênicos são capazes de produzir e secretar insulina humana. Muitos procariotos são capazes de adquirir DNA estranho e incorporar genes funcionais em seu próprio genoma por meio do “acasalamento” com outras células (conjugação), infecção viral (transdução) e captação de DNA do ambiente (transformação). Lembre-se de que esses mecanismos são exemplos de transferência horizontal de genes - a transferência de material genético entre células da mesma geração.

Clonagem Molecular

Herbert Boyer e Stanley Cohen demonstraram pela primeira vez o processo de clonagem molecular completo em 1973, quando clonaram com sucesso os genes da rã africana com garras (Xenopus laevis) em um plasmídeo bacteriano que foi então introduzido no hospedeiro bacteriano Escherichia coli. A clonagem molecular é um conjunto de métodos usados ​​para construir DNA recombinante e incorporá-lo a um organismo hospedeiro; faz uso de uma série de ferramentas moleculares derivadas de microorganismos.

Enzimas de restrição e ligases

Na tecnologia de DNA recombinante, as moléculas de DNA são manipuladas usando enzimas naturais derivadas principalmente de bactérias e vírus. A criação de moléculas de DNA recombinante é possível devido ao uso de endonucleases de restrição de ocorrência natural (enzimas de restrição), enzimas bacterianas produzidas como um mecanismo de proteção para cortar e destruir DNA citoplasmático estranho que é mais comumente um resultado de infecção bacteriófago. Stewart Linn e Werner Arber descobriram enzimas de restrição em seus estudos da década de 1960 sobre como E. coli limita a replicação do bacteriófago na infecção. Hoje, usamos enzimas de restrição extensivamente para cortar fragmentos de DNA que podem então ser unidos em outra molécula de DNA para formar moléculas recombinantes. Cada enzima de restrição corta o DNA em um local de reconhecimento característico, uma sequência de DNA específica, geralmente palíndrômica, tipicamente entre quatro a seis pares de bases de comprimento. Um palíndromo é uma sequência de letras que tem a mesma leitura para a frente e para trás. (A palavra “nível” é um exemplo de palíndromo.) As sequências de DNA palindrômico contêm as mesmas sequências de bases na direção 5ʹ a 3ʹ em uma fita e na direção 5ʹ a 3ʹ na fita complementar. Uma enzima de restrição reconhece o palíndromo de DNA e corta cada estrutura em posições idênticas no palíndromo. Algumas enzimas de restrição cortam para produzir moléculas com saliências complementares (pontas pegajosas), enquanto outras cortam sem gerar essas saliências, em vez de produzir pontas cegas (Figura ( PageIndex {2} )).

Moléculas com extremidades adesivas complementares podem facilmente recozer ou formar ligações de hidrogênio entre bases complementares, em suas extremidades adesivas. A etapa de recozimento permite a hibridização das saliências de fita simples. A hibridização refere-se à união de duas fitas simples complementares de DNA. As extremidades cegas também podem se conectar, mas de forma menos eficiente do que as extremidades adesivas, devido à falta de saliências complementares que facilitam o processo. Em ambos os casos, a ligação por DNA ligase pode então reunir as duas estruturas de açúcar-fosfato do DNA por meio de ligações covalentes, tornando a molécula uma fita dupla contínua. Em 1972, Paul Berg, um bioquímico de Stanford, foi o primeiro a produzir uma molécula de DNA recombinante usando essa técnica, combinando o vírus de macaco SV40 com E. coli bacteriófago lambda para criar um híbrido.

Plasmídeos

Após a digestão de restrição, os genes de interesse são comumente inseridos em plasmídeos, pequenos pedaços de DNA de fita dupla tipicamente circular que se replicam independentemente do cromossomo bacteriano (ver Características Únicas de Células Procarióticas). Na tecnologia de DNA recombinante, os plasmídeos são freqüentemente usados ​​como vetores, moléculas de DNA que carregam fragmentos de DNA de um organismo para outro. Os plasmídeos usados ​​como vetores podem ser geneticamente modificados por pesquisadores e empresas de fornecimento científico para ter propriedades especializadas, conforme ilustrado pelo vetor plasmídeo comumente usado pUC19 (Figura ( PageIndex {3} )). Alguns vetores plasmídeos contêm genes que conferem resistência a antibióticos; esses genes de resistência permitem que os pesquisadores encontrem facilmente colônias contendo plasmídeos plaqueando-as em meio contendo o antibiótico correspondente. O antibiótico mata todas as células hospedeiras que não abrigam o vetor plasmídeo desejado, mas aquelas que contêm o vetor são capazes de sobreviver e crescer.

Os vetores de plasmídeo usados ​​para clonagem normalmente têm um sítio poliligante ou sítio de clonagem múltipla (MCS). Um sítio poliligante é uma sequência curta contendo múltiplos sítios únicos de reconhecimento de enzimas de restrição que são usados ​​para inserir DNA no plasmídeo após a digestão de restrição tanto do DNA quanto do plasmídeo. Ter esses múltiplos locais de reconhecimento de enzimas de restrição dentro do sítio poliligante torna o vetor plasmídeo versátil, de modo que pode ser usado para muitos experimentos de clonagem diferentes envolvendo diferentes enzimas de restrição.

Este sítio poliligante é frequentemente encontrado dentro de um gene repórter, outra sequência de genes artificialmente modificada no plasmídeo que codifica uma proteína que permite a visualização da inserção de DNA. O gene repórter permite ao pesquisador distinguir células hospedeiras que contêm plasmídeos recombinantes com fragmentos de DNA clonados de células hospedeiras que contêm apenas o vetor plasmídeo não recombinante. O gene repórter mais comum usado em vetores de plasmídeo é a bactéria lacZ gene que codifica beta-galactosidase, uma enzima que degrada naturalmente a lactose, mas também pode degradar um análogo sintético incolor X-gal, produzindo colônias azuis em meio contendo X-gal. o lacZ o gene repórter é desativado quando o DNA recombinante é unido ao plasmídeo. Como a proteína LacZ não é produzida quando o gene é desativado, X-gal não é degradada e colônias brancas são produzidas, que podem então ser isoladas. Este método de triagem azul-branco é descrito posteriormente e mostrado na Figura ( PageIndex {4} ). Além dessas características, alguns plasmídeos vêm pré-digeridos e com uma enzima ligada ao plasmídeo linearizado para auxiliar na ligação após a inserção de fragmentos de DNA estranhos.

Clonagem molecular usando transformação

O mecanismo mais comumente usado para a introdução de plasmídeos projetados em uma célula bacteriana é a transformação, um processo no qual as bactérias absorvem DNA livre de seus arredores. Na natureza, o DNA livre normalmente vem de outras células bacterianas lisadas; no laboratório, o DNA livre na forma de plasmídeos recombinantes é introduzido nos arredores da célula.

Algumas bactérias, como Bacilo spp., são naturalmente competentes, o que significa que são capazes de absorver DNA estranho. No entanto, nem todas as bactérias são naturalmente competentes. Na maioria dos casos, as bactérias devem se tornar artificialmente competentes em laboratório, aumentando a permeabilidade da membrana celular. Isso pode ser alcançado por meio de tratamentos químicos que neutralizam cargas na membrana celular ou pela exposição da bactéria a um campo elétrico que cria poros microscópicos na membrana celular. Esses métodos produzem bactérias quimicamente competentes ou eletrocompetentes, respectivamente.

Seguindo o protocolo de transformação, as células bacterianas são semeadas em um meio contendo antibiótico para inibir o crescimento de muitas células hospedeiras que não foram transformadas pelo plasmídeo que confere resistência a antibióticos. Uma técnica chamada rastreio azul-branco é então usada para lacZ- vetores de plasmídeo que codificam, tais como pUC19. As colônias azuis têm uma enzima beta-galactosidase funcional porque o lacZ O gene é ininterrupto, sem DNA estranho inserido no local do poliligante. Essas colônias normalmente resultam do plasmídeo digerido e linearizado religando-se a si mesmo. No entanto, as colônias brancas carecem de uma enzima beta-galactosidase funcional, indicando a inserção de DNA estranho dentro do sítio de poliligante do vetor de plasmídeo, interrompendo assim o lacZ gene. Assim, as colônias brancas resultantes deste rastreio azul-branco contêm plasmídeos com uma inserção e podem ser rastreadas posteriormente para caracterizar o DNA estranho. Para ter certeza de que o DNA correto foi incorporado ao plasmídeo, a inserção de DNA pode então ser sequenciada.

Veja uma animação de clonagem molecular no DNA Learning Center.

Exercício ( PageIndex {2} )

Na tela branco-azulada, o que significa uma colônia azul e por que é azul?

Clonagem molecular usando conjugação ou transdução

O processo bacteriano de conjugação (veja Como os procariotos assexuados alcançam a diversidade genética) também pode ser manipulado para clonagem molecular. Os plasmídeos F, ou plasmídeos de fertilidade, são transferidos entre as células bacterianas por meio do processo de conjugação. O DNA recombinante pode ser transferido por conjugação quando células bacterianas contendo um plasmídeo F recombinante são misturadas com células bacterianas compatíveis sem o plasmídeo. Os plasmídeos F codificam uma estrutura de superfície chamada de pilus F, que facilita o contato entre uma célula contendo um plasmídeo F e outra sem um plasmídeo F. No contato, uma ponte citoplasmática se forma entre as duas células e a célula contendo o plasmídeo F replica seu plasmídeo, transferindo uma cópia do plasmídeo F recombinante para a célula receptora. Uma vez que recebeu o plasmídeo F recombinante, a célula receptora pode produzir seu próprio F pilus e facilitar a transferência do plasmídeo F recombinante para uma célula adicional. O uso de conjugação para transferir plasmídeos F recombinantes para células receptoras é outra forma eficaz de introduzir moléculas de DNA recombinante em células hospedeiras.

Alternativamente, os bacteriófagos podem ser usados ​​para introduzir DNA recombinante nas células bacterianas hospedeiras por meio de uma manipulação do processo de transdução (veja Como os procariotos assexuados alcançam a diversidade genética). No laboratório, os fragmentos de DNA de interesse podem ser manipulados em fagomídeos, que são plasmídeos que possuem sequências de fago que permitem que sejam empacotados em bacteriófagos. As células bacterianas podem então ser infectadas com esses bacteriófagos de modo que os fagemídeos recombinantes possam ser introduzidos nas células bacterianas. Dependendo do tipo de fago, o DNA recombinante pode ser integrado no genoma bacteriano do hospedeiro (lisogenia), ou pode existir como um plasmídeo no citoplasma do hospedeiro.

Exercício ( PageIndex {2} )

  1. Qual é a função original de uma enzima de restrição?
  2. Quais são os dois processos explorados para obter DNA recombinante em uma célula hospedeira bacteriana?
  3. Distinguir os usos de um gene de resistência a antibióticos e um gene repórter em um vetor de plasmídeo.

Criação de uma biblioteca genômica

A clonagem molecular também pode ser usada para gerar uma biblioteca genômica. A biblioteca é uma cópia completa (ou quase completa) do genoma de um organismo contido como plasmídeos de DNA recombinante projetados em clones únicos de bactérias. Ter essa biblioteca permite ao pesquisador criar grandes quantidades de cada fragmento, cultivando o hospedeiro bacteriano para esse fragmento. Esses fragmentos podem ser usados ​​para determinar a sequência do DNA e a função de quaisquer genes presentes.

Um método para gerar uma biblioteca genômica é ligar fragmentos genômicos digeridos por enzimas de restrição individuais em vetores de plasmídeo cortados com a mesma enzima de restrição (Figura ( PageIndex {5} )). Após a transformação em um hospedeiro bacteriano, cada célula bacteriana transformada pega um único plasmídeo recombinante e cresce em uma colônia de células. Todas as células nesta colônia são clones idênticos e carregam o mesmo plasmídeo recombinante. A biblioteca resultante é uma coleção de colônias, cada uma das quais contém um fragmento do genoma do organismo original, que são separadas e distintas e podem ser usadas para estudos posteriores. Isso possibilita aos pesquisadores rastrear esses diferentes clones para descobrir aquele que contém um gene de interesse do genoma do organismo original.

Para construir uma biblioteca genômica usando fragmentos maiores de DNA genômico, um E. coli bacteriófago, como lambda, pode ser usado como um hospedeiro (Figura ( PageIndex {6} )). O DNA genômico pode ser cortado ou digerido enzimaticamente e ligado em um vetor de DNA de bacteriófago lambda pré-digerido. Então, essas moléculas de DNA de fago recombinante podem ser empacotadas em partículas de fago e usadas para infectar E. coli células hospedeiras em uma placa. Durante a infecção dentro de cada célula, cada fago recombinante fará muitas cópias de si mesmo e lisar o E. coli gramado, formando uma placa. Assim, cada placa de uma biblioteca de fago representa um fago recombinante único contendo um fragmento de DNA genômico distinto. As placas podem então ser rastreadas para procurar genes de interesse. Uma vantagem de produzir uma biblioteca usando fagos em vez de plasmídeos é que uma partícula de fago contém uma inserção muito maior de DNA estranho em comparação com um vetor de plasmídeo, exigindo, assim, um número muito menor de culturas para representar totalmente o genoma inteiro do organismo original.

Para focar nos genes expressos em um organismo ou mesmo um tecido, os pesquisadores constroem bibliotecas usando o RNA mensageiro do organismo (mRNA) em vez de seu DNA genômico. Enquanto todas as células de um único organismo terão o mesmo DNA genômico, diferentes tecidos expressam diferentes genes, produzindo diferentes complementos de mRNA. Por exemplo, o DNA genômico de todas as células humanas contém o gene da insulina, mas apenas as células no pâncreas expressam mRNA direcionando a produção de insulina. Como o mRNA não pode ser clonado diretamente, no laboratório o mRNA deve ser usado como molde pela enzima retroviral transcriptase reversa para fazer DNA complementar (cDNA). O complemento total de mRNA de uma célula pode ser transcrito reversamente em moléculas de cDNA, que podem ser usadas como um modelo para a DNA polimerase para fazer cópias de DNA de fita dupla; estes fragmentos podem ser subsequentemente ligados em vetores plasmídicos ou bacteriófagos para produzir uma biblioteca de cDNA. O benefício de uma biblioteca de cDNA é que ela contém DNA apenas dos genes expressos na célula. Isso significa que os íntrons, sequências de controle como promotores e DNA não destinado a ser traduzido em proteínas não estão representados na biblioteca. O foco nas sequências traduzidas significa que a biblioteca não pode ser usada para estudar a sequência e a estrutura do genoma em sua totalidade. A construção de uma biblioteca genômica de cDNA é mostrada na Figura ( PageIndex {7} ).

Exercício ( PageIndex {3} )

  1. Quais são os hospedeiros para as bibliotecas genômicas descritas?
  2. O que é cDNA?

Apresentando moléculas recombinantes em hospedeiros eucarióticos

O uso de hospedeiros bacterianos para engenharia genética lançou as bases para a tecnologia de DNA recombinante; no entanto, os pesquisadores também têm grande interesse na engenharia genética de células eucarióticas, particularmente as de plantas e animais. A introdução de moléculas de DNA recombinante em hospedeiros eucarióticos é chamada de transfecção. Plantas geneticamente modificadas, chamadas de plantas transgênicas, são de interesse significativo para fins agrícolas e farmacêuticos. A primeira planta transgênica vendida comercialmente foi o tomate de maturação retardada Flavr Savr, que chegou ao mercado em 1994. Animais geneticamente modificados também foram produzidos com sucesso, resultando, por exemplo, em porcos com maior valor nutricional1 e cabras que secretam produtos farmacêuticos em seu leite.2

Eletroporação

Em comparação com as células bacterianas, as células eucarióticas tendem a ser menos receptivas como hospedeiras para moléculas de DNA recombinante. Como os eucariotos normalmente não são competentes para absorver DNA estranho nem são capazes de manter plasmídeos, a transfecção de hospedeiros eucarióticos é muito mais desafiadora e requer técnicas mais intrusivas para o sucesso. Um método usado para transfetar células em cultura de células é chamado de eletroporação. Um breve pulso elétrico induz a formação de poros transitórios nas bicamadas fosfolipídicas das células, por meio das quais o gene pode ser introduzido. Ao mesmo tempo, o pulso elétrico gera uma carga positiva de curta duração em um lado do interior da célula e uma carga negativa no lado oposto; a diferença de carga atrai moléculas de DNA com carga negativa para a célula (Figura ( PageIndex {8} )).

Microinjeção

Um método alternativo de transfecção é denominado microinjeção. Como as células eucarióticas são geralmente maiores do que as dos procariotos, os fragmentos de DNA às vezes podem ser injetados diretamente no citoplasma usando uma micropipeta de vidro, conforme mostrado na Figura ( PageIndex {9} ).

Gene Guns

Transfetar células vegetais pode ser ainda mais difícil do que células animais por causa de suas paredes celulares espessas. Uma abordagem envolve o tratamento de células vegetais com enzimas para remover suas paredes celulares, produzindo protoplastos. Em seguida, uma arma genética é usada para atirar partículas de ouro ou tungstênio revestidas com moléculas de DNA recombinante nos protoplastos da planta em altas velocidades. As células protoplásticas receptoras podem então se recuperar e ser usadas para gerar novas plantas transgênicas (Figura ( PageIndex {10} )).

Vetores de transporte

Outro método de transfecção de plantas envolve vetores de transporte, plasmídeos que podem se mover entre células bacterianas e eucarióticas. O tumor indutor (Teu) plasmídeos originários da bactéria Agrobacterium tumefaciens são comumente usados ​​como vetores de transporte para incorporar genes em plantas (Figura ( PageIndex {11} )). Na natureza, o Teu plasmídeos de A. tumefaciens fazer com que as plantas desenvolvam tumores quando são transferidas de células bacterianas para células vegetais. Os pesquisadores foram capazes de manipular esses plasmídeos de ocorrência natural para remover seus genes causadores de tumor e inserir fragmentos de DNA desejáveis. O T recombinante resultanteeu plasmídeos podem ser transferidos para o genoma da planta através da transferência natural de Teu plasmídeos da bactéria para a planta hospedeira. Uma vez dentro da célula hospedeira da planta, o gene de interesse se recombina no genoma da célula da planta.

Vetores Virais

Os vetores virais também podem ser usados ​​para transfectar células eucarióticas. Na verdade, esse método é frequentemente usado em terapia gênica (consulte Terapia Gênica) para introduzir genes saudáveis ​​em pacientes humanos que sofrem de doenças que resultam de mutações genéticas. Os genes virais podem ser deletados e substituídos pelo gene a ser entregue ao paciente;3 o vírus então infecta a célula hospedeira e entrega o DNA estranho ao genoma da célula-alvo. Os adenovírus são frequentemente usados ​​para esse propósito porque podem ser cultivados em títulos elevados e podem infectar células hospedeiras que não se dividem ou se dividem. No entanto, o uso de vetores virais para terapia gênica pode representar alguns riscos para os pacientes, conforme discutido em Terapia Gênica.

Exercício ( PageIndex {4} )

  1. Quais são os métodos usados ​​para introduzir vetores de DNA recombinante em células animais?
  2. Compare e contraste vetores de transporte e vetores virais.

Conceitos-chave e resumo

  • Biotecologia é a ciência de utilizar sistemas vivos para beneficiar a humanidade. Nos últimos anos, a capacidade de alterar diretamente o genoma de um organismo por meio genético Engenharia foi possível devido aos avanços em tecnologia de DNA recombinante, que permite aos pesquisadores criar moléculas de DNA recombinante com novas combinações de material genético.
  • Clonagem molecular envolve métodos usados ​​para construir DNA recombinante e facilitar sua replicação em organismos hospedeiros. Esses métodos incluem o uso de Enzimas de restrição (para cortar DNA estranho e vetores de plasmídeo), ligadura (para colar fragmentos de DNA juntos), e a introdução de DNA recombinante em um organismo hospedeiro (geralmente bactérias).
  • Triagem branco-azulada permite a seleção de transformantes bacterianos que contêm plasmídeos recombinantes usando o fenótipo de um gene repórter que é desativado pela inserção do fragmento de DNA.
  • Bibliotecas genômicas pode ser feito clonando fragmentos genômicos de um organismo em vetores de plasmídeo ou em bacteriófago.
  • Bibliotecas de cDNA podem ser gerados para representar as moléculas de mRNA expressas em uma célula em um determinado ponto.
  • Transfecção de hospedeiros eucarióticos pode ser alcançado através de vários métodos usando eletroporação, armas genéticas, microinjeção, vetores de transporte, e vetores virais.

Múltipla escolha

Qual das alternativas a seguir é necessária para reparar a estrutura fosfodiéster do DNA durante a clonagem molecular?

A. cDNA
B. transcriptase reversa
C. enzimas de restrição
D. DNA ligase

D

Todos os seguintes são processos usados ​​para introduzir moléculas de DNA em células bacterianas exceto:

A. transformação
B. transdução
Transcrição de C.
D. conjugação

C

A enzima que usa o RNA como modelo para produzir uma cópia do DNA é chamada de:

A. uma enzima de restrição
B. DNA ligase
C. transcriptase reversa
D. DNA polimerase

C

Na triagem branco-azulada, o que as colônias azuis representam?

A. células que não pegaram o vetor de plasmídeo
B. células com plasmídeos recombinantes contendo uma nova inserção
C. células contendo vetores de plasmídeo vazios
D. células com um não funcional lacZ gene

C

O Teu plasmídeo é usado para introduzir genes em:

A. células animais
B. células vegetais
C. bacteriófagos
D. E. coli células

B

Verdadeiro falso

A recombinação é um processo geralmente não observado na natureza.

falso

É geralmente mais fácil introduzir DNA recombinante em células procarióticas do que em células eucarióticas.

verdade

Preencher a lacuna

O processo de introdução de moléculas de DNA em células eucarióticas é denominado ________.

Resposta curta

Cite três elementos incorporados em um vetor de plasmídeo para uma clonagem eficiente.

Quando um cientista iria querer gerar uma biblioteca de cDNA em vez de uma biblioteca genômica?

Qual é a vantagem de gerar uma biblioteca genômica usando fagos em vez de plasmídeos?

Pensamento crítico

A biotecnologia está sempre associada à engenharia genética? Explique sua resposta.

O que é mais eficiente: clonagem de ponta cega ou clonagem de ponta pegajosa? Porque?

Notas de rodapé

  1. 1 Liangxue Lai, Jing X. Kang, Rongfeng Li, Jingdong Wang, William T. Witt, Hwan Yul Yong, Yanhong Hao et al. “Generation of Cloned Transgenic Pigs Rich in Omega-3 Fatty Acids.” Nature Biotechnology 24 não. 4 (2006): 435–436.
  2. 2 Raylene Ramos Moura, Luciana Magalhães Melo e Vicente José de Figueirêdo Freitas. “Production of Recombinant Proteins in Milk of Transgenic and Non-Transgenic Goats.” Arquivos Brasileiros de Biologia e Tecnologia 54 não. 5 (2011): 927–938.
  3. 3 William S.M. Wold e Karoly Toth. "Vetores de adenovírus para terapia gênica, vacinação e terapia gênica do câncer." Terapia genética atual 13 não. 6 (2013): 421.

13 Vantagens e Desvantagens da Engenharia Genética

O processo de engenharia genética permite que a estrutura dos genes seja alterada. É uma modificação deliberada que ocorre por meio da manipulação direta do material genético de um organismo. O DNA é adicionado ou subtraído para produzir um ou mais novos traços que não foram encontrados naquele organismo antes.

Com a engenharia genética, é possível criar plantas que podem resistir a herbicidas enquanto crescem. Também se torna possível criar novas ameaças ao nosso suprimento de alimentos ou saúde pessoal porque os vírus e bactérias continuam a se adaptar às mudanças que são produzidas por meio desse processo.

Aqui estão as vantagens e desvantagens da engenharia genética a serem consideradas.

Quais são as vantagens da engenharia genética?

1. Permite uma taxa de crescimento mais rápida.
A engenharia genética permite que plantas ou animais sejam modificados para que sua maturidade ocorra em um ritmo mais rápido. A engenharia pode permitir que essa maturidade ocorra fora das condições normais de crescimento, que também são favoráveis, sem mudanças genéticas. Mesmo que haja níveis mais elevados de calor ou níveis mais baixos de luz, torna-se possível expandir o que pode ser cultivado nessas condições.

2. Pode criar uma vida útil prolongada.
A modificação genética pode ajudar a criar resistência às formas comuns de morte de organismos. A resistência a pragas pode ser incluída nos perfis genéticos das plantas para que possam amadurecer como uma cultura sem quaisquer aditivos adicionais. Os animais podem ter seus perfis genéticos modificados para reduzir os riscos de problemas de saúde comuns que podem afetar a raça ou espécie. Isso cria o potencial para uma vida útil prolongada para cada organismo.

3. Traços específicos podem ser desenvolvidos.
Plantas e animais podem ter características específicas desenvolvidas por meio da engenharia genética que podem torná-los mais atraentes para uso ou consumo. Cores diferentes podem ser criadas para produzir uma gama mais ampla de produtos. Os animais podem ser modificados para produzir mais leite, desenvolver mais tecido muscular ou produzir casacos diferentes para que uma variedade maior de tecidos possa ser criada.

4. Novos produtos podem ser criados.
Com a engenharia genética, novos produtos podem ser criados adicionando ou combinando diferentes perfis. Um exemplo disso é pegar um produto específico, como a batata, e alterar seu perfil para que ele possa produzir mais nutrientes por kcal do que sem a engenharia genética. Isso possibilita que mais pessoas obtenham o que precisam nutricionalmente, mesmo que seu acesso aos alimentos seja limitado, e isso poderia reduzir a insegurança alimentar global.

5. Maiores rendimentos podem ser produzidos.
A engenharia genética também pode alterar as características de plantas ou animais para que produzam maiores rendimentos por planta. Mais frutas podem ser produzidas por árvore, o que cria um maior suprimento de alimentos e mais lucros para o agricultor. Também cria o potencial para o uso de organismos modificados de várias maneiras, porque há uma maior produção disponível. Milho modificado, por exemplo, pode ser usado para fins específicos, como ração animal, etanol ou espigas maiores para consumo humano.

6. Os riscos para o abastecimento de água local são reduzidos.
Como os agricultores e cultivadores não precisam aplicar tantos pesticidas ou herbicidas em suas áreas de cultivo devido à engenharia genética, menos aplicações no solo precisam ocorrer. Isso protege a bacia hidrográfica local e reduz o risco de ocorrência de um evento adverso, sem comprometer a produção e a lucratividade necessárias.

7. É uma prática científica que existe há milênios.
Os humanos no passado podem não ter sido capazes de modificar diretamente o DNA de uma planta ou animal em um laboratório, mas eles ainda praticavam a engenharia genética por meio de reprodução seletiva e cruzamentos de espécies ou cruzamentos. As pessoas identificariam características específicas, procurariam outras plantas ou animais que tivessem características semelhantes e depois os cruzariam para criar um resultado específico. A engenharia genética apenas acelera esse processo e pode prever um resultado com maior regularidade.

Quais são as desvantagens da engenharia genética?

1. O valor nutricional dos alimentos pode ser menor.
Quando os animais crescem e amadurecem rapidamente, o valor nutricional desse produto pode ser reduzido. Isso pode ser visto em produtos de aves hoje com as listras brancas que são encontradas em produtos de carne. Essa listra é um depósito de gordura que foi criado, muitas vezes na carne do peito, devido ao rápido crescimento da ave. Em frangos, a Good Housekeeping relata que isso pode aumentar o teor de gordura da carne consumida em mais de 220%. Ao mesmo tempo, a quantidade de proteína recebida também é reduzida.

2. Os patógenos se adaptam aos novos perfis genéticos.
A engenharia genética pode criar uma resistência natural contra certos patógenos para plantas e animais, mas o processo evolutivo natural é voltado para a criação de caminhos. Bactérias e vírus desenvolvem uma resistência à resistência criada pelos esforços da engenharia genética. Isso faz com que os patógenos se tornem mais fortes e resistentes do que normalmente seriam, potencialmente criando problemas de saúde futuros que são imprevistos.

3. Pode haver efeitos colaterais negativos inesperados.
A engenharia genética certamente fará uma mudança. Muitas dessas mudanças são positivas, criando mais alimentos e mais saudáveis. Algumas dessas mudanças, no entanto, podem ser negativas e inesperadas. Tornar uma planta mais tolerante à seca também pode torná-la menos tolerante à luz solar direta. Os animais podem ser modificados para produzir mais leite, mas têm uma vida útil mais curta ao mesmo tempo, de modo que os fazendeiros têm um gado maior.

4. A quantidade de diversidade desenvolvida pode ser menos favorável.
Em algum ponto, plantas e animais geneticamente modificados chegam à “natureza” e interagem com as espécies domésticas. Isso resulta em um cruzamento de organismos “naturais” e “artificiais”. Os organismos modificados geralmente dominam, resultando em apenas uma espécie modificada ao longo de várias gerações, reduzindo a diversidade disponível.

5. A engenharia genética protegida por direitos autorais pode ter consequências caras.
Muitas empresas protegem os direitos autorais de seus processos ou produtos de engenharia genética para manter sua lucratividade. Se um agricultor planta safras geneticamente modificadas e o processo de polinização faz com que outro agricultor no campo cresça essas safras modificadas, tem havido precedentes para ações judiciais contra o agricultor “não autorizado”. Isso pode ter várias consequências caras, desde menos agricultores querendo trabalhar até um custo mais alto para as sementes que são plantadas.

6. Este conhecimento e tecnologia podem ser facilmente abusados.
No momento, a engenharia genética em humanos está sendo usada para tratar distúrbios específicos que ameaçam a saúde ou o bem-estar dos indivíduos. Com o tempo, a abordagem em humanos pode ser semelhante ao que já está sendo feito com plantas e animais. A engenharia genética pode mudar características específicas, o que pode criar resultados humanos que são eticamente questionáveis ​​ou facilmente abusados.

As vantagens e desvantagens da engenharia genética mostram que os resultados podem ser geralmente positivos, mas deve haver controles para gerenciar o negativo quando ele ocorrer.


Seleção

Um marcador selecionável é geralmente um gene que confere resistência a um antibiótico que, de outra forma, mataria as células.

Objetivos de aprendizado

Identificar o propósito da seleção em engenharia genética

Principais vantagens

Pontos chave

  • O DNA recombinante é introduzido no organismo a partir do qual as sequências de replicação foram obtidas, então o DNA estranho será replicado junto com o DNA da célula hospedeira & # 8217s no organismo transgênico.
  • A seleção genética artificial é o processo no qual células que não absorveram DNA são seletivamente mortas, e apenas aquelas células que podem replicar ativamente o DNA contendo o gene marcador selecionável codificado pelo vetor são capazes de sobreviver.
  • Quando células bacterianas são usadas como organismos hospedeiros, o marcador selecionável é geralmente um gene que confere resistência a um antibiótico que, de outra forma, mataria as células, normalmente a ampicilina.

Termos chave

  • clonagem molecular: um conjunto de métodos experimentais em biologia molecular que são usados ​​para montar moléculas de DNA recombinante e para direcionar sua replicação dentro de organismos hospedeiros.
  • PCR: reação em cadeia da polimerase

Os cientistas que fazem genética experimental empregam experimentos de seleção artificial que permitem a sobrevivência de organismos com fenótipos definidos pelo usuário. A seleção artificial é amplamente utilizada no campo da genética microbiana, especialmente na clonagem molecular.

A recombinação de DNA tem sido usada para criar substituições, deleções, inserções e inversões de genes. A clonagem de genes e marcação de genes / proteínas também são comuns. Para substituições ou deleções de genes, geralmente um cassete que codifica um gene de resistência a drogas é feito por PCR.

A clonagem molecular é um conjunto de métodos experimentais em biologia molecular que são usados ​​para montar moléculas de DNA recombinante e para direcionar sua replicação dentro de organismos hospedeiros. O uso da palavra clonagem se refere ao fato de que o método envolve a replicação de uma única molécula de DNA a partir de uma única célula viva para gerar uma grande população de células contendo moléculas de DNA idênticas. A clonagem molecular geralmente usa sequências de DNA de dois organismos diferentes: a espécie que é a fonte do DNA a ser clonado e a espécie que servirá como hospedeiro vivo para a replicação do DNA recombinante. Os métodos de clonagem molecular são fundamentais para muitas áreas contemporâneas da biologia e da medicina modernas.

Em um experimento de clonagem molecular convencional, o DNA a ser clonado é obtido de um organismo de interesse. Em seguida, é tratado com enzimas no tubo de ensaio para gerar fragmentos de DNA menores. Posteriormente, esses fragmentos são então combinados com o DNA do vetor para gerar moléculas de DNA recombinante. O DNA recombinante é então introduzido em um organismo hospedeiro (normalmente uma cepa de laboratório benigna, fácil de crescer E. coli bactérias). Isso irá gerar uma população de organismos nos quais as moléculas de DNA recombinante são replicadas junto com o DNA do hospedeiro. Por conterem fragmentos de DNA estranhos, são microrganismos transgênicos ou geneticamente modificados (OGM). Este processo tira vantagem do fato de que uma única célula bacteriana pode ser induzida a assumir e replicar uma única molécula de DNA recombinante. Esta única célula pode então ser expandida exponencialmente para gerar uma grande quantidade de bactérias, cada uma das quais contendo cópias da molécula recombinante original. Assim, tanto a população bacteriana resultante quanto a molécula de DNA recombinante são comumente referidas como & # 8220clones & # 8221. A rigor, o DNA recombinante se refere às moléculas de DNA, enquanto a clonagem molecular se refere aos métodos experimentais usados ​​para montá-las.

A clonagem molecular tira proveito do fato de que a estrutura química do DNA é fundamentalmente a mesma em todos os organismos vivos. Portanto, se qualquer segmento de DNA de qualquer organismo for inserido em um segmento de DNA contendo as sequências moleculares necessárias para a replicação do DNA, e o DNA recombinante resultante for introduzido no organismo a partir do qual as sequências de replicação foram obtidas, o DNA estranho será replicado along with the host cell’s DNA in the transgenic organism.

A clonagem molecular é semelhante à reação em cadeia da polimerase (PCR), pois permite a replicação de uma sequência de DNA específica. A diferença fundamental entre os dois métodos é que a clonagem molecular envolve a replicação do DNA em um microrganismo vivo, enquanto a PCR replica o DNA em uma solução in vitro, livre de células vivas. Whichever method is used, the introduction of recombinant DNA into the chosen host organism is usually a low efficiency process that is, only a small fraction of the cells will actually take up DNA. Cientistas experimentais lidam com essa questão por meio de uma etapa de seleção genética artificial, na qual células que não absorveram DNA são seletivamente mortas, e apenas aquelas células que podem replicar ativamente o DNA contendo o gene marcador selecionável codificado pelo vetor são capazes de sobreviver. Quando células bacterianas são usadas como organismos hospedeiros, o marcador selecionável é geralmente um gene que confere resistência a um antibiótico que, de outra forma, mataria as células, normalmente a ampicilina. As células que abrigam o vetor sobreviverão quando expostas ao antibiótico, enquanto aquelas que não captam as sequências do vetor morrem. Quando células de mamíferos (por exemplo, células humanas ou de camundongo) são usadas, uma estratégia semelhante é usada, exceto que o gene marcador (neste caso, normalmente codificado como parte do cassete kanMX) confere resistência ao antibiótico Geneticina.

Plasmid vector map: This vector confers amplicillin resistance.


Molecular biology – is the study of the structure, function & makeup of the molecular building blocks of life. It focuses on the interactions between the various system of a cell, including the interrelationship of DNA, RNA & Protein synthesis &how these interaction are regulated. Bioscience, Molecular biology closely interrelate with the fields of Biochemistry, Genetics & Cell biology.

Molecular biology is a specialised branch of biochemistry, the study of the chemistry of molecules which are specifically connected to living processes. Importance to molecular biology are the nucleicacids (DNA and RNA) and the proteins which are constructed using the genetic instructions encoded in those molecules.

Other biomolecules, such as carbohydrates and lipids may also be studied for the interactions they have with nucleic acids and proteins. Molecular biology is often separated from the field of cell biology, which concentrates on cellular structures (organelles and the like), molecular pathways within cells and cell life cycles.

Engenharia genética

Genetic Engineering is the act of modifying the genetic makeup of an organism. Modification can be generated by methods such as gene therapy, nuclear transplantation, transfection of synthetic chromosome or viral insertion.

The manipulation of genetic make up of living cells by inserting desired genes through a DNA vector, is the genetic engineering. The gene is a small piece of DNA that encodes for a specific protein. The gene is inserted into a vector DNA so that a new combination of vector DNA is formed.

The DNA formed by joining DNA segments of two different organisms is called recombinant DNA. The organism whose genetic make up is manipulated using recombinant DNA technique, is called genetically manipulated organism (GMO). Genetic engineering has many application in agriculture, animal science, industry and medicines (Figure 1.3).

Genetically Modified Organism (GMO)

Organism genome has been engineered in the laboratory in order to favour the expression of desired physiological traits or the production of desired biological products. In conventional livestock production, crop farming, and even pet breeding, it has long been the practice to breed select individuals of a species in order to produce offspring that have desirable traits.

In genetic modification, however, recombinant genetic technologies are employed to produce organisms whose genomes have been precisely altered at the molecular level, usually by the inclusion of genes from unrelated species of organisms that code for traits that would not be obtained easily through conventional selective breeding.

GMOs are produced through using scientific methods that include recombinant DNA technology and reproductive cloning. In reproductive cloning, a nucleus is extracted from a cell of the individual to be cloned and is inserted into the enucleated cytoplasm of a host egg.

The process results in the generation of an offspring that is genetically identical to the donor individual. The first animal produced by means of this cloning technique with a nucleus from an adult donor cell (as opposed to a donor embryo) was a sheep named Dolly, born in 1996.

Since then a number of other animals, including pigs, horses, and dogs, have been generated by reproductive cloning technology. Recombinant DNA technology, on the other hand, involves the insertion of one or more individual genes from an organism of one species into the DNA (deoxyribonucleic acid) of another.

Whole-genome replacement, involving the transplantation of one bacterial genome into the “cell body,” or cytoplasm, of another microorganism, has been reported, although this technology is still limited to basic scientific applications.


Bacterial genome engineering and synthetic biology: combating pathogens

Background: The emergence and prevalence of multidrug resistant (MDR) pathogenic bacteria poses a serious threat to human and animal health globally. Nosocomial infections and common ailments such as pneumonia, wound, urinary tract, and bloodstream infections are becoming more challenging to treat due to the rapid spread of MDR pathogenic bacteria. According to recent reports by the World Health Organization (WHO) and Centers for Disease Control and Prevention (CDC), there is an unprecedented increase in the occurrence of MDR infections worldwide. The rise in these infections has generated an economic strain worldwide, prompting the WHO to endorse a global action plan to improve awareness and understanding of antimicrobial resistance. This health crisis necessitates an immediate action to target the underlying mechanisms of drug resistance in bacteria.

Research: The advent of new bacterial genome engineering and synthetic biology (SB) tools is providing promising diagnostic and treatment plans to monitor and treat widespread recalcitrant bacterial infections. Key advances in genetic engineering approaches can successfully aid in targeting and editing pathogenic bacterial genomes for understanding and mitigating drug resistance mechanisms. In this review, we discuss the application of specific genome engineering and SB methods such as recombineering, clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR), and bacterial cell-cell signaling mechanisms for pathogen targeting. The utility of these tools in developing antibacterial strategies such as novel antibiotic production, phage therapy, diagnostics and vaccine production to name a few, are also highlighted.

Conclusões: The prevalent use of antibiotics and the spread of MDR bacteria raise the prospect of a post-antibiotic era, which underscores the need for developing novel therapeutics to target MDR pathogens. The development of enabling SB technologies offers promising solutions to deliver safe and effective antibacterial therapies.

Palavras-chave: Antibacterial Antibiotic resistance Gene circuits Genome engineering Multidrug resistant (MDR) pathogens Pathogenesis Quorum sensing Recombineering Synthetic Biology (SB) Targetron.


Benefits of Genetic Engineering

Genetic engineering process manipulates the DNA sequence to create a new one. The write-up focuses on the various benefits of genetic engineering.

Genetic engineering process manipulates the DNA sequence to create a new one. The write-up focuses on the various benefits of genetic engineering.

The genes present in the body of all living organisms helps determine the organism’s habits. Genetic engineering is defined as a set of technologies that are used to change the genetic makeup of cells and move the genes from one species to another to produce new organisms. The techniques used are highly sophisticated manipulations of genetic material and other biologically important chemicals.

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What are the Benefits of Genetic Engineering
Genetic engineering in its present form has been around for approximately 25 years. It has also been a very widely debated topic from its beginning in 1970s. There are many social consequences that are associated with genetic engineering, that makes the overall risk or benefit assessment very complicated. The benefits of genetic engineering in each field is mentioned below.

Human Cloning: Almost everyday, a scientist makes a new breakthrough in the field of human engineering. Mammals have been successfully cloned and the human genome project has been completed. This is pushing the scientists all over the world to research many different facets of human genetic engineering. These researches have allowed a better understanding of DNA and its role in medicine, pharmacology, reproductive technology and various other fields. The scientists at Roslin Institute in Scotland, cloned an exact copy of a sheep, named ‘Dolly’. Newly created animals by the process of genetic engineering are known as xenographs.

Medical Treatment: In humans, the most promising benefit of genetic engineering is gene therapy which is the medical treatment of a disease wherein the defective genes are repaired and replaced or therapeutic genes are introduced to fight the disease. Over the past decade, many autoimmune and heart diseases have been treated using gene therapy. Certain diseases like the Huntington’s disease, ALS and cystic fibrosis is caused by defective genes. There is hope that a cure for such diseases can be found by either inserting the corrected gene or modifying the defective gene. Eventually, the hope is to completely eliminate genetic diseases and also treat non-genetic diseases with appropriate gene therapy. The latest research in the field makes it possible to repair or grow new muscle cells when they are not working or are damaged.

Pharmaceuticals: Thanks to genetic engineering, the pharmaceutical products available today are far superior to their predecessors. These new products are created by cloning certain genes. Some of the prominent examples are the bio-engineered insulin which was earlier obtained from sheep or cows and the human growth hormone which was earlier obtained from cadavers. New medicines are being made by changing the genetic structure of the plant cell.

Pregnancy Cases: Genetic engineering is also a boon for pregnant women who can choose to have their fetuses screened for genetic defects. These screenings can help the parents and doctors prepare for the arrival of the child who may have special needs during or after the delivery. A possible future benefit of genetic engineering which is very eagerly awaited is that a fetus with a genetic defect could be treated with genetic therapy even before it is born. Research is going on for gene therapy for embryos before it is implanted into the mother via in-vitro fertilization. The latest term coined is ‘Designer Babies’ wherein the couple can actually choose the features of the baby to be born!

Agriculture: The field of agriculture too greatly benefits from genetic engineering which has improved the genetic fitness of various plant species. The common benefits are increase in the efficiency of photosynthesis, increasing the resistance of the plant to salinity, drought and viruses and also reducing the plant’s need for a nitrogen fertilizer. The latest research at Cornell University is to map the ‘Oat’ crop so that extra nutrients can be added to the sequence and the make the crop healthier. Similar research is done with the ‘Soya’ crop as well.

Here is a list of some of the most upfront benefits of genetic engineering:

  • Genetic engineering when used on microorganisms help in the creation of new pharmaceuticals which cannot be made in any other way.
  • Genetic engineering helps in the process of bio remediation which is the process of cleaning up waste and pollution with the help of living organisms.
  • Genetic engineering has helped lower the overall usage of herbicide and pesticide.
  • Genetic engineering has helped with the production of vaccines and other drugs in plants.
  • Genetic engineering has helped produce quicker and more predictable way of generating new cultivars. Further, the cultivar properties are better known today than it was ever known before.
  • Today, genetic engineering can produce sustainable agriculture.
  • Genetic engineering has produced very useful genetically modified breeds which can tolerate factory farming without any suffering.
  • In humans, genetic engineering is used to treat genetic disorders and cancer. It also helps in supplying new body parts.
  • Although, this has not been done today, genetic engineering has the potential of creating new types of human beings with many advantageous traits.
  • Anti-sense mRNA technology.
  • Genetic engineering is used in the field of mining to extract useful elements from the ones they are actually embedded into.
  • Certain bacterial sequences are manipulated to transform waste into ethanol, so that it can be used as a fuel.

The pros of genetic engineering are far too many to list. But it is important to understand the boundaries to which the human race can push itself and stop before man starts playing the role of God.

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Here is a list of a genetic engineer’s molecular tools/enzymes most commonly used in genetic engineering experiments:

1. Polymerase Chain Reaction (PCR)

Polymerase Chain Reaction (PCR) is the process of replicating multiple copies of the genes of interest. The discovery of thermostable DNA polymerases, such as Taq Polymerase, has made it possible to manipulate DNA replication in the laboratory. It amplifies the quantities of DNA segments. Primers are used to identify the gene of interest and replicate them. These copies can then be separated and purified using gel electrophoresis.

2. Restriction Enzymes (Molecular Scissor)

The discovery of enzymes known as restriction endonucleases has been essential to protein engineering. Based on the nucleotide sequence, these enzymes cut DNA at specific locations. DNA cut with a restriction enzyme produces many smaller fragments of varying sizes. These can be separated using gel electrophoresis or chromatography.

3. Gel Electrophoresis

Purifying DNA from cell culture, or cutting it using restriction enzymes wouldn’t be of much use if we couldn’t visualize the DNA. Gel electrophoresis helps visualize the size and type of DNA extracted using PCR and restriction enzymes. It is also used to detect DNA inserts and knockouts.

4. DNA Ligase

DNA ligase can create covalent bonds between nucleotide chains. This is done to create recombinant strands or close a circular strand that has been cut by restriction enzymes. The enzymes DNA polymerase I and polynucleotide kinase are also important for filling in gaps or phosphorylating the 5′ ends, respectively.

5. Plasmids

Plasmids are small, circular pieces of DNA that are not part of the bacterial genome but are capable of self-replication. It is used as vectors to transport genes between microorganisms. Once the gene of interest has been amplified with PCR, the gene and plasmid are cut by restriction enzymes and ligated together. The resulting combination is known as Recombinant DNA. Viral (bacteriophage) DNA can also be used as a vector, as can cosmids, which are recombinant plasmids containing bacteriophage genes.

6. Transformation/Transduction

Transformação is the process of transferring genetic material in a vector, such as a plasmid, into host cells. The host cells are exposed to an environmental change, such as electroporation, which makes them “competent” or temporarily permeable to the vector. The larger the plasmid, the lower the efficiency with which it is taken up by cells.

Larger DNA segments are more easily cloned using bacteriophage, retrovirus, or other viral vectors or cosmids in a method called Transduction. Phage or viral vectors are often used in regenerative medicine but may cause the insertion of DNA in parts of our chromosomes where we don’t want it, causing complications and even cancer.

7. Identifying Transgenic Organisms

Not all cells will take up DNA during transformation. Therefore, it is essential to identify the cells that undergo a transformation and those that have not. Generally, plasmids carry genes for antibiotic resistance, and transgenic cells can be selected based on the expression of those genes and their ability to grow on media containing that antibiotic. Alternative methods of selection depend on the presence of other reporter proteins such as the x-gal/lacZ system, or green fluorescence protein, which allow selection based on color and fluorescence, respectively.


10 Tools Used in Genetic Engineering

You may have heard about genetic engineering in newspapers, TV shows, and the Internet. Sci-fi movies like X-Men depict individuals with enhanced genetic modification that give them special abilities.

So, what exactly is Genetic Engineering? Genetic engineering involves the manipulation of genetic material (DNA) to achieve the desired goal in a pre-determined way.

Here are ten tools that are commonly used in genetic engineering:

1. Polymerase Chain Reaction

PCR is known as the polymerase chain reaction. It is efficient because it multiplies the DNA exponentially for each of the 25 to 75 cycles. A cycle takes only a minute, and each new segment of DNA that is made can serve as a template for new ones.

2. Restriction Enzymes (Molecular Scissor)

The discovery of enzymes known as restriction endonucleases has been essential to protein engineering. These enzymes cut DNA at specific locations based on the nucleotide sequence. Hundreds of different Enzimas de restrição, capable of cutting DNA at a distinct site, have been isolated from many different strains of bacteria. DNA cut with a restriction enzyme produces many smaller fragments of varying sizes. These can be separated using gel electrophoresis or chromatography.

3. Gel Electrophoresis

Purifying DNA from cell culture, or cutting it using restriction enzymes wouldn’t be of much use if we couldn’t visualize the DNA – that is, find a way to view whether or not your extract contains anything, or what size fragments you’ve cut it into. One way to do this is by gel electrophoresis. Gels are used for a variety of purposes, from viewing cut DNA to detecting DNA inserts and knockouts.

4. DNA Ligase

In genetic research, it is often necessary to link two or more individual strands of DNA, to create a recombinant strand, or close a circular strand that has been cut with restriction enzymes. Enzymes called DNA ligases can create covalent bonds between nucleotide chains. The enzymes DNA polymerase I and polynucleotide kinase are also important in this process, for filling in gaps, or phosphorylating the 5′ ends, respectively.

5. Polymerases:

The groups of enzymes that catalyze the synthesis of nucleic acid molecules are collectively referred to as polymerases. It is customary to use the name of the nucleic acid template on which the polymerase acts. The three important polymerases are given below.

  • DNA-dependent DNA polymerase that replicates DNA from DNA.
  • RNA-dependent DNA polymerase (reverse transcriptase) that transcribes DNA from RNA.
  • DNA-dependent RNA polymerase that transcribes RNA from DNA

6. Prokaryotic Host

The bacterium, Escherichia coli, was the first organism used in the DNA technology experiments and continues to be the host of choice by many workers. Undoubtedly, E.coli, the simplest Gram-negative bacterium (a common bacterium of human and animal intestine), has played a key role in the development of present-day biotechnology.

Under a suitable environment, the number of E. coli can double every 20 minutes. As the bacteria multiply, their plasmids (along with foreign DNA) also multiply to produce millions of copies, referred to as a colony or in a short clone. The term ‘clone’ broadly refers to a mass of cells, organisms, or genes that results from the multiplication of a single cell, organism, or gene.

7. Eukaryotic Host

Eukaryotic organisms are preferred to produce human proteins since these hosts with complex structures (with distinct organelles) are more suitable to synthesize complex proteins. The most commonly used eukaryotic organism is the yeast, Saccharomyces cerevisiae. It is a non-pathogenic organism routinely used in the brewing and baking industry. Certain fungi have also been used in gene cloning experiments.

8. Sel ection of Small Self-Replicating DNA

Small circular pieces of DNA that are not part of a bacterial genome, but are capable of self-replication, are known as plasmids. Plasmids are often used as vectors to transport genes between microorganisms. In biotechnology, once the gene of interest has been amplified and both the gene and plasmid are cut by restriction enzymes, they are ligated together, generating what is known as a recombinant DNA. Viral (bacteriophage) DNA can also be used as a vector, as can cosmids, recombinant plasmids containing bacteriophage genes.

9. Transformation

The process of transferring genetic material on a vector such as a plasmid, into new host cells, is called transformation. This technique requires that the host cells are exposed to an environmental change, which makes them “competent” or temporarily permeable to the vector. Electroporation is one such technique. The larger the plasmid, the lower the efficiency with which it is taken up by cells. Larger DNA segments are more easily cloned using bacteriophage, retrovirus, or other viral vectors or cosmids in a method called transduction. Phage or viral vectors are often used in regenerative medicine but may cause the insertion of DNA in parts of our chromosomes where we don’t want it, causing complications and even cancer.

10. Metho ds to Select Transgenic Organisms

Not all cells will take up DNA during transformation. Therefore, it is essential to identify the cells that undergo a transformation and those that have not. Generally, plasmids carry genes for antibiotic resistance, and transgenic cells can be selected based on the expression of those genes and their ability to grow on media containing that antibiotic. Alternative methods of selection depend on the presence of other reporter proteins such as the x-gal/lacZ system, or green fluorescence protein, which allow selection based on color and fluorescence, respectively.


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